Avaliação da Virulência Bacteriana Usando o Ensaio de Toxicidade Líquida C. elegans

Resumo

Fonte: Chen, Y., et al. Avaliando a Virulência e Patogênese da Infecção por Aeromonas em um Modelo de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra o Ensaio de Toxicidade Líquida de C. elegans com Aeromonas, um método usado para avaliar a virulência bacteriana medindo a sobrevivência de vermes em um ambiente líquido com poucos nutrientes. O ensaio revela patogenicidade específica da cepa com base na extensão do dano induzido por toxinas e na mortalidade em C. elegans.

Protocolo

1. Ensaio de Toxicidade Líquida de C. elegans com Aeromonas

NOTA: Para evitar contaminação, os passos devem ser realizados em um exaustor de fluxo laminar.

1. No dia seguinte à semeadura dos vermes L1 na placa ENGM (meio de crescimento de nematoides enriquecidos) espalhe com E. coli OP50, colhe uma única colônia de cada uma das quatro cepas Aeromonas e E. coli OP50, e cultive com 5 mL de caldo de 5 mL cada a 37 °C por 16 horas.
   NOTA: No protocolo, foram usadas as seguintes cepas bacterianas: E. coli OP50, a fonte alimentar normal de C. elegans. A. dhakensis AAK1, o primeiro isolado clínico patogênico totalmente sequenciado de A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 e A. caviae A2-9307121 são isolados clínicos representativos do Hospital Nacional da Universidade Cheng Kung.  
   NOTA: Para preparar GNM enriquecido (ENGM), dissolva 3 g de NaCl, 5 g de peptona bacteriana, 1 g de extrato de levedura e 30 g de ágar em 1 L de água deionizada. Autoclave a 121 °C por 20 minutos. Espere até que esteja resfriado a 55 °C em banho-maria e adicione 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de colesterol a 5% em etanol e 25 mL de tampão fosfatado. Gire para misturar bem.
2. Meça a absorção OD₆₀₀ do caldo de bactérias.
3. Centrifuge o caldo bacteriano a 3.500 x g por 15 minutos para remover o caldo LB. Resuspenda as bactérias e ajuste o caldo bacteriano para OD₆₀₀ = 3,0 com meio S. Adicione 195 μL de caldo bacteriano em meio S a pelo menos 8 poços de uma placa de 96 poços.
   NOTA: Composição do meio S: Para preparar o meio S, misture 40 mL de S basal, 0,4 mL de citrato de potássio de 1 M, 0,4 mL de solução de metais traço, 0,12 mL de 1 M_{CaCl 2}, 0,12 mL de 1 M MgSO₄, 40 μL de colesterol 5% em etanol e 1 mL de 8 mM FudR antes do uso.
4. Lave os worms L4 na placa ENGM com E. coli OP5 usando meio M9. Ajuste a solução de verme para uma concentração de 5 minhocas por μL e adicione 5 μL da solução de verme a cada poço da placa de 96 poços. Certifique-se de que haja aproximadamente 25 minhocas por poço.
5. Incube a placa de 96 poços em um shaker a 200 rpm a 25 °C.
6. Conte o número de vermes vivos e mortos após 24, 48 e 72 horas. Calcule as taxas de sobrevivência de cada poço com a seguinte fórmula: (Vermes vivos/Vermes totais) × 100%.
7. Desenhe um gráfico de gráfico de dispersão com o cálculo diário dos dados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Incubadora shaker	YIH DER	LM-570R	Incubação de bactérias
NaCl	SIGMA	31434	Preparação do meio de cultura
MgSO₄	SIGMA	M7506	Preparação do meio de cultura
Agar	Difco	214530	Preparação do meio de cultura
CaCl₂	SIGMA	C1016	Preparação do meio de cultura
Colesterol	SIGMA	C8503	Preparação do meio de cultura
Etanol	SIGMA	32205	Preparação do meio de cultura
KOH	SIGMA	P5958	Preparação do meio de cultura
Placa de Petri de 6 cm	ALPHA PLUS	46	Preparação da placa de ágar
Placa de 96 poços	FALCON	353072	Ensaio líquido
Peptôna bacteriana	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Preparação do meio de cultura
Extrato de levedura	SIGMA	92144	Preparação do meio de cultura
Ácido cítrico•H₂O	SIGMA	C1909	Preparação do meio de cultura
Tri-potássio•H₂O	SIGMA	104956	Preparação do meio de cultura
FudR	SIGMA	1271008	Preparação do meio de cultura
EDTA dissódico	SIGMA	E1644	Preparação do meio de cultura
Triptona	SIGMA	16922	Preparação do meio de cultura
Sistema de microscópio	Nikon	Eclipase Ti invertida	Imagem de microscópio
Câmera CCD Científica	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	Imagem de microscópio