Ensaio de necrose muscular em C. elegans induzido por uma cepa patogênica de Aeromonas

Resumo

Fonte: Chen, Y. et al., Avaliando a Virulência e Patogênese da Infecção por Aeromonas em um Modelo de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra um ensaio de necrose muscular em C. elegans (Caenorhabditis elegans) usando cepas patogênicas de Aeromonas . Ao alimentar minhocas que expressam proteína fluorescente verde (GFP) em placas com sementes de Aeromonas, o ensaio modela infecção bacteriana e revela danos teciduais por meio de imagens por fluorescência. A perda progressiva da estrutura muscular e do sinal de GFP indica uma resposta necrótica induzida por Aeromonas.

Protocolo

1. Ensaio de Necrose Muscular de Caenorhabditis elegans com Aeromonas

NOTA: Para evitar contaminação, esses passos devem ser realizados em um exaustor de fluxo laminar.

1. No dia em que os vermes L1 são semeados no meio enriquecido de crescimento nematoide (ENGM) espalhado com Escherichia coli OP50, selecione uma única colônia de cada uma das quatro cepas de Aeromonas e E. coli OP50 e cultive com 2 mL de caldo Luria-Bertani (LB) cada a 37 °C por 16 horas. NOTA: Aqui, as seguintes cepas bacterianas foram usadas: E. coli OP50, a fonte normal de alimento de C. elegans. A. dhakensis AAK1, o primeiro isolado clínico patogênico de A. dhakensis totalmente sequenciado. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 e A. caviae A2-9307121 são isolados clínicos representativos do Hospital Nacional da Universidade Cheng Kung.
2. Meça a absorção OD₆₀₀ do caldo de bactérias e ajuste o caldo de bactérias para_{OD 600} = 2,0 com LB de caldo. Espalhe e espalhe 30 μL de caldo bacteriano em placas de meio de crescimento de nematoides (NGM) de 6 cm. Cultive as placas em temperatura ambiente durante a noite.
3. No dia em que os vermes L1 crescerem para o estágio L4, transfira 50 vermes para cada placa NGM com cada uma das quatro cepas Aeromonas ou E. coli OP50. Incube as placas NGM a 20 °C. Transfira vermes a cada 24 horas para placas NGM recém-preparadas com bactérias.
4. Tire imagens musculares usando um microscópio de fluorescência.
   1. Escolha aleatoriamente 10 vermes em um gel de agarose a 2% em meio M9 em uma lâmina. Paralise os vermes usando 2 μL de azida de sódio a 1% em meio M9 em agarose por menos de 5 minutos antes de tirar imagens.
   2. Coloque uma capa e capture as imagens musculares usando um filtro de proteína fluorescente verde (GFP) em um microscópio fluorescente com câmera de dispositivo acoplado de carga. Capture as imagens musculares às 24, 48 e 72 horas após o estágio L4.

Realize análise de imagens e preparação de figuras com um software de processamento de imagem.
NOTA: As definições das pontuações e dos níveis de lesão muscular são mostradas na Figura 1, para a qual os critérios são listados da seguinte forma: 3 pontos por falta de fibras musculares; 2 pontos para fibras musculares rompidas ou quebradas; 1 ponto para fibras musculares dobradas; 0 pontos por fibras musculares saudáveis.

Resultados

Figura 1: As pontuações correspondentes para necrose muscular em C. elegans induzida por infecção por Aeromonas. Os critérios para necrose muscular e as pontuações corres...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Incubadora shaker	YIH DER	LM-570R	Incubação de bactérias
K₂HPO₄	J.T. Baker	MP021519455	Preparação do meio de cultura
KH₂PO₄	J.T. Baker	3246-05	Preparação do meio de cultura
Na₂HPO₄	J.T. Baker	MP021914405	Preparação do meio de cultura
NaCl	SIGMA	31434	Preparação do meio de cultura
MgSO₄	SIGMA	M7506	Preparação do meio de cultura
Agar	Difco	214530	Preparação do meio de cultura
CaCl₂	SIGMA	C1016	Preparação do meio de cultura
Colesterol	SIGMA	C8503	Preparação do meio de cultura
Etanol	SIGMA	32205	Preparação do meio de cultura
KOH	SIGMA	P5958	Preparação do meio de cultura
Placa de Petri de 6 cm	ALPHA PLUS	46	Preparação em placa de ágar
Peptôna bacteriana	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Preparação do meio de cultura
Extrato de levedura	SIGMA	92144	Preparação do meio de cultura
Ácido cítrico•H₂O	SIGMA	C1909	Preparação do meio de cultura
Tri-potássio•H₂O	SIGMA	104956	Preparação do meio de cultura
FudR	SIGMA	1271008	Preparação do meio de cultura
EDTA dissódico	SIGMA	E1644	Preparação do meio de cultura
FeSO₄·7H₂O	SIGMA	215422	Preparação do meio de cultura
MnCl₂·4H₂O	SIGMA	221279	Preparação do meio de cultura
ZnSO₄·7H₂O	SIGMA	204986	Preparação do meio de cultura
CuSO₄·5H₂O	SIGMA	C8027	Preparação do meio de cultura
Triptona	SIGMA	16922	Preparação do meio de cultura
Sistema de microscópio	Nikon	Eclipase Ti invertida	Imagem ao microscópio
Câmera CCD Científica	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	Imagem ao microscópio