Estabilização mediada por fibras de curli em padrões de hidrogel bacteriano

Resumo

Fonte: Spiesz, E. M., et al., Padronização Tridimensional de Biofilmes Engenheirados com uma Bioimpressora Faça-você-mesmo. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um método para comparar padrões de alginato impressos em 3D contendo cepas bacterianas controle ou geneticamente modificadas. A cepa de teste produz fibras de curli na indução, que reforçam a estrutura do hidrogel de alginato. Após o tratamento com solução quelante de cálcio, apenas o padrão de teste permanece intacto, destacando o efeito estabilizador da produção de fibras de curli.

Protocolo

1. 3D Processo de impressão

1. Instale e abra o software de impressão 3D (Table of Materials) em um computador. Conecte a impressora 3D ao computador. Mova o cabeçote de impressão para a posição inicial clicando no botão home dos eixos X, Y e Z.
2. Para cada impressão, coloque um substrato de impressão preparado em um local específico da base de impressão.
3. Calibre a altura do cabeçote de impressão no eixo Z.
   1. Eleve a cabeça de impressão a uma altura de 22 mm sob controle manual, para que ela não colida com a borda da placa de Petri ao se mover para a posição desejada. Posicione a cabeça de impressão sobre a placa e mova-a para baixo até que a ponta da pipeta toque a superfície de impressão. Atribua essa posição do eixo Z como Z1 (a altura da superfície de impressão).
   2. Levante o cabeçote de impressão e mova-o para fora da área da placa por controle manual nos eixos X, Y e Z. Se a distância de trabalho entre o cabeçote de impressão e a superfície da placa for definida como Z2, insira Z1 + Z2 no programa de impressão como o valor Z durante a impressão.
4. Programe a forma de impressão por um método auto-desenvolvido ponto a ponto e coordenadas determinadas, de acordo com a trajetória desejada.
   1. Se a trajetória desejada for uma linha reta, defina apenas os pontos de início e fim. Incluir pontos adicionais em linhas curvas resultará em curvas mais suaves. Mova o cabeçote de impressão manualmente para cada ponto sequencialmente e registre as coordenadas desses pontos em ordem. Insira todas essas coordenadas, assim como a velocidade de movimento do cabeçote de impressão para cada segmento impresso no editor de G-code.
5. Antes e depois da impressão, levante o cabeçote a uma distância acima da borda da placa (20 mm) e mova-se diretamente para fora da região da placa. Salve esse programa como um arquivo G-code e carregue diretamente para uso em impressões subsequentes, enquanto mede novamente a altura do eixo Z para cada novo substrato de impressão.
   NOTA: Veja a Tabela 1 para um exemplo de código G para imprimir um quadrado.
6. Carregue o arquivo G-code pré-programado. Abra o editor de G-code no software e programe os comandos para imprimir a forma desejada. Em cada linha de comando, a posição do cabeçote de impressão pode ser alterada nos eixos X, Y e/ou Z. Insira o valor Z durante todas as etapas de impressão como Z1 + Z2 (altura da superfície de impressão + distância de trabalho).
   NOTA: A velocidade de movimento também é ajustável; 9.000 mm/min é um valor adequado para taxas de impressão típicas.
7. Coloque a bio-tinta líquida na(s) seringa(s) e instale-as na(s) bomba(s) de seringa da bioimpressora 3D.
8. Imprima a bio-tinta no substrato de impressão clicando no botão Imprimir.
9. Durante a impressão, controle o movimento do cabeçote de impressão inteiramente pelo software. Ligue manualmente a bomba da seringa antes que o cabeçote de impressão entre em contato com a superfície de impressão.
   NOTA: A coordenação da bomba de seringa e da impressora é determinada empiricamente dependendo da velocidade de extrusão, da velocidade com que o cabeçote de impressão se move até o primeiro ponto de impressão e da posição inicial do cabeçote de impressão. Se a posição inicial do cabeçote de impressão for de 20 mm, com velocidade de 9.000 mm/min e velocidade de extrusão de 0,1 mL/h, inicie a bomba de seringa imediatamente após o início da impressão. Se a velocidade de extrusão for alterada de 0,1 mL/h para 0,3 mL/h, espere 2−3 s para iniciar a bomba de seringa após o início da impressão.
10. Pare a bomba da seringa assim que o cabeçote de impressão chegar ao último ponto de impressão. Pare a bomba da seringa antes que a cabeça de impressão se levante ao final do processo de impressão, caso contrário, o excesso de bio-tinta cairá sobre o substrato de impressão e reduzirá a resolução de impressão.
11. Para a construção de estruturas 3D, controle todos os movimentos do cabeçote de impressão no editor de código G. Digite a altura de impressão da primeira camada. Aumente o valor Z no código G em 0,2 milímetros para a segunda camada para aumentar a altura de impressão. A partir daí, aumente o valor Z em 0,1 milímetro ao passar para uma camada superior. Não mova a placa durante o processo de impressão.
12. Para medir a largura e a altura do hidrogel impresso, use uma régua de aço colocada abaixo ou ao lado da amostra.

2. Cultivo e teste da eficácia da produção de biofilmes por E. coli

1. Incube as amostras impressas em temperatura ambiente por 3 a 6 dias para permitir a produção dos componentes do biofilme (fibras do cacho). Fotografe as placas usando uma câmera ou scanner fluorescente.
2. Para dissolver a matriz de alginato, adicione 20 mL de solução de citrato de sódio 0,5 M (pH = 7 ajustado com NaOH) aos substratos de impressão e incube por 2 horas com agitação de 30 rpm em temperatura ambiente. Descarte o líquido e fotografe as placas novamente para comparar com as imagens das placas antes do tratamento com citrato.

Tabela 1: Processo de programação e explicações do código G para impressão de um quadrado.

Comandos G-code	Tarefas
G1 Z20 F9000	Eleve o eixo Z a uma altura de 20 mm com uma velocidade de movimento de 9.000 mm/min.
G1 X95 Y65 F9000	Avance para o ponto de partida da primeira linha com uma velocidade de 9.000 mm/min.
G1 Z6 F9000	Descer na direção Z até uma distância de impressão adequada (aqui Z = 6 mm).
G1 X95 Y105 F300	Ponto final da primeira linha e ponto de partida da segunda linha.
G1 X135 Y105	Ponto final da segunda linha e ponto de partida da terceira linha.
G1 X135 Y65	Ponto final da terceira linha e ponto de partida da quarta linha.
G1 X95 Y65	Ponto final da quarta linha e ponto de partida da primeira linha; forma-se um quadrado.
G1 Z20 F9000	Eleve o eixo Z para uma altura de 20 mm a 9.000 mm/min.
G1 X55 Y40 F9000	Mova-se para uma coordenada (55, 40) fora da faixa da placa de Petri.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pó de caldo LB	Sigma-Aldrich	L3022
Agitador orbital	VWR	89032-092	Modelo 3500
Placa de Petri	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Tubo de silício	VWR	DENE 3100103/25
Bomba de seringa	ProSense B.V.	NE-300
Alginato de sódio	Sigma-Aldrich	W201502
Citrato de sódio monobásico	Sigma-Aldrich	71498
Hidróxido de sódio	VWR	28244.295