Realização de Cromatografia em Camadas Finas para Avaliar a Degradação de Exopolissacarídeos Bacterianos

Resumo

Fonte: Hu, Y., et al. Análise das Interações entre Endobióticos e Microbiota Intestinal Humana Utilizando Sistemas de Fermentação em Banhos In Vitro. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o uso da cromatografia de camada fina (TLC) para avaliar a degradação de exopolissacarídeos (EPS) pela microbiota fecal humana. Fragmentos de EPS em supernadantes de fermentação são separados com base em tamanho e polaridade usando TLC, e então visualizados como faixas coloridas após a coloração específica de carboidratos.

Protocolo

1. Degradação de exopolissacarídeos (EPS) pela microbiota fecal humana

1. Coloque 0,2 μL de supernadantes fermentados em placas de alumínio de cromatografia de camada fina (TLC) de gel de sílica pré-revestidas, depois seque usando um secador de cabelo.
2. Desenvolva as placas em 20 mL de uma solução de ácido fórmico/n-butanol/água (6:4:1, v:v:v) e seque usando um secador de cabelo.
3. Deixe as placas de molho no reagente Orcinol para tingir e depois seque usando um secador de cabelo.
   1. Prepare os reagentes de orcinol dissolvendo 900 mg de liquenol em 25 mL de água destilada, depois adicionando 375 mL de etanol. Como resultado, o ácido sulfúrico concentrado deve ser adicionado lentamente e a solução bem misturada.
4. Aqueça as placas a 120 °C por 3 minutos em um forno de assamento e avalie a degradação do EPS medindo as bandas de TLC.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Forno de assado	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A	Uso para aquecer e assar
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023	Uso para preparar vitamina K1
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	399388	Usado para cuidados carinhosos
Liquénol	Solarbio	C8380	Uso para preparar a placa colorida
n-Butanol	ChemSpider	71-36-3	Usado para cuidados carinhosos
Orcinol	Sigma-Aldrich	447420	Usado para preparar reagentes de orcinol
Ácido sulfúrico	Sigma-Aldrich	150692	Usado para preparar reagentes de orcinol
Chapas de alumínio TLC	MerckMillipore	116835	Usado para cuidados carinhosos