Investigando a Atividade Microbiana Intestinal Humana em Exopolissacarídeos

Resumo

Fonte: Hu, Y. et.al., Análise das Interações entre Endobióticos e Microbiota Intestinal Humana Usando Sistemas de Fermentação em Banhos In Vitro. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a análise da produção de ácidos graxos de cadeia curta pela microbiota intestinal humana em resposta a exopolissacarídeos. Isso destaca a separação e quantificação dos produtos de fermentação microbiana usando cromatografia gasosa. Os resultados revelam que exopolissacarídeos modulam metabólitos microbianos que influenciam a dinâmica hospedeiro-patógeno no intestino.

Protocolo

1. Efeitos do exopolissacarídeo (EPS) na produção de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA) pela microbiota intestinal humana
   1. Adicione os supernadantes fermentados (1 mL) preparados no passo 5,3 a tubos de centrífuga de 2 mL.
   2. Adicione 0,2 mL de ácido metafosfórico a 25% (p/v) a cada uma das amostras e misture cuidadosamente as soluções por vortex.
   3. Centrifuge as misturas a 13.000 x g por 20 minutos e transfira os supernadantes para tubos novos.
   4. Simultaneamente, prepare soluções de 120 mM de ácidos acético, propiônico, butírico, isobutírico, valérico e isovalérico. Depois, adicione 1 mL de cada ácido preparado a 1,2 mL de ácido metafosfórico 25% (p/v) e use como coquetéis padrão.
   5. Filtre as amostras usando uma membrana de 0,22 μM.
   6. Detectar concentrações de SCFA usando cromatografia gasosa de alta performance.
      NOTA: Uma coluna FFAP InertCap (0,25 mM x 30 m x 0,25 μM) é usada para cromatografia gasosa (GC). As concentrações de SCFA são então quantificadas com base nas áreas de pico usando o método padrão interno de ponto único no pacote de software GC Solution.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtros de membrana de 0,22 μm	Millipore	SLGP033RB	Uso para filtrar amostras
Peneira de 0,4 mm	Thermo Fischer	308080-99-1	Uso para preparar amostras de fezes humanas
Acético	Sigma-Aldrich	71251	Exemplo padrão para SCFA
Butírico	Sigma-Aldrich	19215	Exemplo padrão para SCFA
Coluna capilar	SHIMADZU-GL	InertCap FFAP (0,25 mm × 30 m × 0,25 μm)	Usado para detecção SCFA
Cromatografia gasosa	Corporação Shimadzu	GC-2010 Plus	Usado para detecção SCFA
Isobutírico	Sigma-Aldrich	46935-U	Exemplo padrão para SCFA
Ácidos isovaléricos	Sigma-Aldrich	129542	Exemplo padrão para SCFA
Ácido Metafosfórico	Sigma-Aldrich	B7350	Exemplo padrão para SCFA
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Solução básica usada para ajustar o pH dos tampões
Propiônico	Sigma-Aldrich	94425	Exemplo padrão para SCFA
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Exemplo padrão para SCFA