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1. Montagem de Microscópio e Aquisição em Tempo Acelerado
NOTA: O protocolo descrito aqui foi desenvolvido para um microscópio de campo amplo invertido com autofoco, um objetivo PH3 de óleo de 100X/1,30 NA, um palco motorizado X, Y, uma câmera sCMOS, uma fonte de luz, filtros para proteínas verde-fluorescentes, vermelhas-fluorescentes ou amarelas-fluorescentes, e uma câmara de incubação com controle de temperatura. Essa câmara mantém as células protegidas da luz e em temperatura constante.
- Pré-aqueça a câmara de incubação e o microscópio a 32 °C por ~1 a 2 horas antes de iniciar a microscopia.
NOTA: Dependendo do sistema do microscópio, o aquecimento pode demorar mais. O pré-aquecimento é essencial para reduzir o desvio e estabiliza o sistema de controle de autofoco. - Ligue o microscópio e inicie o software de controle do microscópio. Selecione o objetivo correto e os espelhos e filtros corretos para adquirir imagens de contraste de fase, bem como imagens de proteínas verde-fluorescentes, vermelhas fluorescentes ou amarelo-fluorescentes.
NOTA: Um microscópio normalmente é fornecido com software preferencial para controle e aquisição de imagens. Aqui, um software comercialmente disponível (veja a Tabela de Materiais) era usado para controlar o microscópio e a aquisição de imagens. - Adicione uma gota de óleo de imersão de alta qualidade à lente objetiva e ao fundo da amostra, pré-incubada a 32 °C. Coloque a objetiva na posição Z mais baixa possível para evitar danificá-la quando a amostra for colocada no palco do microscópio. Coloque a estrutura metálica com a amostra sobre o palco do microscópio, com o "lado do furo" voltado para o objetivo. Prenda a amostra firmemente no suporte do palco.
- Foque nas células movendo o palco na direção Z mais próximo do objetivo. Mova o estágio lentamente quando o óleo cair na parte inferior da amostra e a lente objetiva fizer contato. Mova o estágio na direção X/Y até que várias células individuais fiquem visíveis na região de visão, quando as células estiverem no plano focal. Certifique-se de que pelo menos uma microsfera fluorescente esteja na região de visão para alinhar posteriormente as imagens adquiridas.
NOTA: Sob condições ideais, deve ser alcançada uma densidade celular de 15 a 30 células por região de visão (2.048 x 2.048 pixels ou 133,1 x 133,1 μm). - Abra o assistente de Aquisição Multidimensional do software de controle do microscópio para montar um experimento em lapso de tempo que permita ao microscópio adquirir imagens em múltiplos comprimentos de onda e posições de estágio, se necessário.
- Na aba principal, ative Timelapse e Múltiplos Comprimentos de Onda. Abas adicionais aparecerão no lado esquerdo da janela.
- Clique na aba Salvar e selecione Diretório para selecionar uma pasta vazia no disco rígido do computador para salvar as imagens adquiridas. Ative o nome base do Incremento se o arquivo existir para garantir que conjuntos de dados consecutivos não sobrescrevam os anteriores. Depois, dê ao experimento um nome com data e o nome da cepa ou título do experimento.
- Clique na aba Time-lapse para ajustar os parâmetros do time-lapse. Defina a duração para 24 horas e o intervalo de tempo para 20 minutos. O número de Pontos de Tempo mudará automaticamente.
NOTA: O intervalo de tempo ótimo depende do experimento e da função celular a ser analisada. Aquisições frequentes de imagens podem causar fotobranqueamento. Assim, é preciso encontrar empiricamente um equilíbrio entre resolução temporal e fotobranqueamento. Com um tempo de duplicação de 4 a 6 horas, imagens podem ser facilmente adquiridas em intervalos de 5 minutos (ou até menores se desejado) para microscopia de contraste de fase. Se se desejarem microscopias de fluorescência ao longo de 24 horas, as imagens devem ser registradas em intervalos de aproximadamente 15 a 30 minutos. - Clique na aba Comprimentos de Onda . Selecione o número de comprimentos de onda a serem adquiridos para cada imagem em cada ponto de tempo mudando o número.
NOTA: Para cada comprimento de onda, uma nova aba aparecerá no lado esquerdo do assistente de "Aquisição Multidimensional " e os comprimentos de onda serão adquiridos na ordem de cima para baixo. Para cada comprimento de onda, as configurações de aquisição podem ser modificadas separadamente. - Clique na primeira aba de comprimento de onda a partir do topo. Selecione Contraste de Fase na lista suspensa de Iluminação . Selecione 100 ms para Exposição e selecione Cada Ponto de Tempo na lista suspensa de Adquirir . Desative o Auto Expose selecionando Nunca na lista suspensa.
- Repita o passo 3.5.5 para cada comprimento de onda que precisa ser adquirido em cada ponto de tempo. Para o montar experimental e proteínas marcadas fluorescentemente descritas aqui, use os seguintes parâmetros para Exposição: 250 ms para proteínas de fusão mCherry, 200 ms para proteínas de fusão YFP (proteína fluorescente amarela) e 1.000 ms para proteínas de fusão GFP (proteína fluorescente verde).
NOTA: As configurações ideais de iluminação para cada cepa e proteína fluorescente devem ser determinadas antecipadamente, alterando a intensidade da lâmpada e o tempo de aquisição da imagem para cada comprimento de onda. Tempos de aquisição de imagem muito longos aumentam o efeito fototóxico e, em última análise, levam à parada do crescimento e à morte celular. Portanto, deve-se alcançar um equilíbrio entre qualidade de imagem e viabilidade celular. - Adquira imagens de múltiplas posições de estágio para aumentar o número de células registradas no mesmo experimento.
- Para adquirir imagens de múltiplas posições de palco, ative Múltiplas Posições de Palco na aba Principal . Depois, clique na aba Palco e clique no botão Live para ver o campo de visão.
- Mova o palco na direção X/Y até que uma região de interesse (ROI) esteja no campo de visão. Salve as coordenadas X e Y clicando no "+" na aba Stage . Mova o palco novamente na direção X/Y até encontrar um novo retorno do investimento e salve as coordenadas novamente clicando no "+". Continue até salvar o número desejado de regiões.
NOTA: No caso de aquisição de imagem por fluorescência, certifique-se de que as regiões de interesse (ROIs) não estejam muito próximas umas das outras para minimizar a fototoxicidade.
- Verifique mais uma vez que as células estão em foco clicando nas diferentes posições X e Y salvas e inicie o autofoco do hardware clicando em AFC hold para manter a posição Z salva constante ao longo do experimento.
- Inicie as gravações em time-lapse no software de controle do microscópio clicando em Adquirir no assistente de Aquisição Multidimensional .
NOTA: Uma janela aparecerá para cada comprimento de onda adquirido, e uma janela adicional mostrará o número de pontos de tempo adquiridos e o tempo até a próxima aquisição da imagem. - Verifique se as células ainda estão em foco após os primeiros pontos de tempo nas gravações em time-lapse para maximizar a qualidade das imagens e refocar se necessário.