Imagem em Time-Lapse de Células Vivas da Predação de Bdellovibrio bacteriovorus em E. coli

Resumo

Fonte: Makowski, Ł., et al. Imagem de Células Vivas do Ciclo de Vida do Predador Bacteriano Bdellovibrio bacteriovorus usando Microscopia de Fluorescência em Time-Lapse. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra imagens de fluorescência em time-lapse de Bdellovibrio bacteriovorus predando E. coli imobilizada sob uma almofada de agarose, permitindo visualização em tempo real da replicação intracelular e liberação de prole para estudar predação bacteriana e interações hospedeiro-patógeno.

Protocolo

1. Condução da microscopia de fluorescência em lapso de tempo

1. Coloque a placa de 35 mm no suporte da placa de Petri de modo que ela não se mova durante o experimento. Coloque uma gota de óleo de imersão (índice de refração de 1,518) sobre o objetivo e também sobre o fundo da antena de 35 mm.
2. Monte o suporte no palco do microscópio invertido na câmara do microscópio.
3. Configure as opções no software de controle do microscópio para coletar múltiplas imagens em diferentes posições de estágio ao longo do tempo.
   1. Ajuste a ampliação (100x) e a lente policrômica (GFP (proteína fluorescente verde)/mCherry). Usando uma ocular e campo claro (BF), encontre o plano focal e abra o gerenciador de listas de pontos.
   2. Selecione pelo menos 10 posições de interesse movendo o palco e armazenando as coordenadas de cada posição no software do microscópio clicando no botão Marcar o Ponto . Evite posições próximas umas das outras para evitar fotobranqueamento e fototoxicidade. Vire a válvula da câmera do ocular para o monitor e calibre cada ponto ajustando o plano focal e clicando no botão Substituir ponto no gerenciador da lista de pontos.
   3. Abra o projetista do experimento e defina todos os parâmetros experimentais em cada aba da seguinte forma:
      1. Desmarque a caixa de empilhamento Z .
      2. Escolha canais fluorescentes e defina as configurações ideais de iluminação. Aqui, foram usadas as seguintes configurações: para o canal mCherry, conjuntos de filtros mCherry (EX575/25; EM625/45), 50% de intensidade e tempo de exposição de 200 ms; para o canal GFP, conjunto de filtros GFP (EX475/28; EM525/48), 50% de intensidade e 80 ms; e para as imagens BF, canal POL, intensidade de 5% e 50 ms.
      3. Selecione intervalos entre a aquisição das imagens e o tempo total do experimento. Aqui, intervalos de 5 minutos foram realizados ao longo do período de 10 horas do experimento.
      4. Ative a manutenção do foco para as posições escolhidas (para o sistema usado aqui, marcando a caixa Manter o foco com o UltimateFocus ).
      5. Selecione a pasta de dados onde os arquivos de imagem devem ser salvos automaticamente.
      6. Verifique todas as configurações no controle do software do microscópio e então inicie o experimento de time-lapse.
4. Após a primeira hora do experimento, verifique se todas as posições do palco ainda estão em foco. Ajuste o foco durante intervalos de tempo entre as aquisições da imagem, se necessário.
5. Quando o experimento de time-lapse for concluído, remova a placa de Petri e utilize a placa de 35 mm com uma almofada de agarose, conforme o protocolo de biossegurança.
   NOTA: Todos os subpassos após o passo 1.2 são específicos para usuários do DeltaVision Elite. Pesquisadores que utilizam outros sistemas precisam ajustar as configurações de acordo com os sistemas individuais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Biologia Molecular Certificada Agarose	BIO-RAD	161-3100	Agarose de baixa fluorescência para a almofada de agarose
Fiji	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Pacote de processamento de imagens de código aberto
Prato inferior de vidro 35 mm	ibidi	81218-200	Vidro não revestido
Microscópio	GE	DeltaVision Elite	Microtiter Stage, módulo laser de foco definitivo, câmera DV Elite CoolSnap HQ2, conjunto SSI FP DV, kit obj. Oly 100x óleo 1.4 NA, prisma Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
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