Visualizando a distribuição de proteínas bacterianas em três dimensões por meio de imagem por fluorescência

Abstract

Fonte: Bratton, B. P., et al., Imagem tridimensional de células bacterianas para representações celulares precisas e localização precisa de proteínas. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o método para adquirir e analisar imagens de fluorescência tridimensionais de células bacterianas para estudar a organização das proteínas no nível de célula única.

Protocol

1. Imagem

1. Insira a lâmina selada no microscópio e deixe-a repousar por 5 minutos para equilibrar a temperatura com o ambiente. A sala do microscópio pode estar em uma temperatura diferente da sala de preparação da amostra.
2. Pegue uma pilha z fluorescente da amostra.
   NOTA: A pilha z deve cobrir inteiramente a amostra com um espaçamento z menor que a profundidade do campo. Para células de E. coli com 1,45 NA 100x objetivo e ~1 μm de espessura, 40 passos a 100 nm por passo funcionam bem. Para células maiores ou que não ficam perfeitamente planas na superfície, podem ser necessários 50 ou mais passos. Inclua passos suficientes e certifique-se de que a amostra esteja totalmente desfocada acima e abaixo.
   1. Use o software associado ao microscópio (veja Tabela de Materiais) para controlar o microscópio.
   2. Foque no meio da célula usando as rodas de foco do microscópio. Sob aquisição ND, marque a caixa Z para pegar uma pilha z. Clique no botão Home para definir o centro da célula como ponto de partida. Defina o tamanho do Passo para 0,1 μm e ajuste o Alcance para 4 μm. Certifique-se de que o dispositivo Z esteja configurado para a etapa piezo.
   3. Ajuste os canais fluorescentes sob a Janela Lambda nas configurações das moléculas fluorescentes que estão sendo visualizadas. Neste experimento, foram usados GFP e mCherry.
      NOTA: Pegue um z-stack adicional com o mesmo Tamanho de Passo e Alcance no segundo canal de cor se a distribuição 3D de um canal fluorescente adicional for desejável. Neste experimento, o mCherry citoplasmático foi usado para determinar o formato celular e o MreB-GFP foi usado como um segundo canal de cor.
   4. Certifique-se de que a Ordem do Experimento esteja definida como lambda (série z) para que ele receba uma pilha completa de z em cada canal de cor antes de mudar.
   5. Clique em Executar Agora para iniciar a aquisição da imagem e salve o arquivo assim que uma ou ambas as z-stacks estiverem completas.
   6. Mova para uma nova área no pad e repita os passos 1.2.2-1.2.5.

2. Reconstrução Celular

1. Recorte células individuais e salve as imagens como um arquivo tiff empilhado para que haja apenas uma célula por arquivo. Certifique-se de que essa célula esteja bem isolada de quaisquer outras células (ou seja, aproximadamente 5x o máximo de meia largura total da função de borrão em xy).
   NOTA: Isso pode ser feito usando softwares de análise de imagens disponíveis gratuitamente (veja Tabela de Materiais).
   1. Desenhe uma caixa ao redor de uma célula individual e duplique essa célula 2x, uma vez para cada canal. Certifique-se de que a caixa duplicada do hyperstack esteja marcada e mude o canal para 1 ou 2, garantindo que as fatias incluam toda a pilha z.
      NOTA: Se for feita apenas a imagem do formato das células e não de uma proteína fluorescente adicional, apenas um canal estará presente.
   2. Quando ambas as pilhas estiverem disponíveis, vá para Imagens | Stacks | Ferramentas | Concatene para combinar as imagens primeiro com o canal de proteína e depois com o canal de forma.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	sigma-Aldrich	A9539
Cotonete	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	Costumava aplicar VaLaP
Slips de cobertura	VWR	16004-302
Fiji	ImageJ	https://fiji.sc	Usado para cro células
Lanolina	Sigma-Aldrich	L7387	Combine com parafina e vaselina para fazer VaLaP
Meio de crescimento LB	BD Difco	DF0446173
M63 médio	Biologia dos EUA	M1015
MATLAB	Mathworks		Precisavam rodar scripts de convolução para frente
Lâminas de microscópio	Fisher	12-550-133
Elementos NIS	Nkon
Parafina	Sigma-Aldrich	327212
Vaselina	Equalizar	49035-038-27
Estágio piezo z	Nikon	77011589
Pontas de pipeta -p200	USA Scientific	1111-0730
Pontas de pipeta - p10	USA Scientific	1111-3730