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1. Determinação dos Níveis de Colonização Intestinal
NOTA: A colonização intestinal é a métrica mais útil no modelo do peixe-zebra, pois pode ser usada para comparar a aptidão relativa de várias cepas de V. cholerae ou os efeitos de mutações ou eliminações gênicas.
1. Eutanásia
1. Quando o experimento atingir o desfecho desejado, coleta uma amostra da água da infecção (15 mL geralmente é suficiente) para permitir a contagem de bactérias excretadas e a medição de diarreia (como ensaio de mucina, teor proteico e/ou OD), se desejado.
2. Despeje o restante da água através de uma rede de arrastão (para coletar os peixes) em água sanitária para matar a V. cholerae na água.
3. Coloque o peixe em um béquer contendo água de infecção mais 336 μg/mL de etil 3-aminobenzoato metanosulfonato (tricaína) e incube o peixe nessa solução de tricaína por 20 minutos em RT.
NOTA: As redes de arrastão foram esterilizadas com uma solução de água sanitária a 10%.
2. Dissecação
1. Preparação de peixes
1. Retire um peixe da solução de tricaína com uma colher plástica descartável e coloque-o sobre a superfície de dissecação.
2. Posicione o peixe com o lado ventral voltado para cima e prenda-o pela mandíbula inferior, com a extremidade romba do alfinete inclinada para longe do centro do corpo. Coloque outro pino logo atrás do ânus, também inclinado para longe do corpo.
2. Exposição do trato intestinal
1. Esfregue a superfície ventral do peixe com um lenço sem fiapos mergulhado em 70% de etanol.
2. Esterilize um bisturi e uma tesoura Vannas mergulhando-os em etanol a 70% e incendiando-os.
3. Faça uma pequena incisão longitudinal na barriga, logo abaixo da pele, penetrando as escamas e usando o bisturi. Tenha cuidado para não cortar muito fundo, pois o trato intestinal está localizado logo abaixo da pele.
4. Usando a tesoura, estenda a incisão cuidadosamente ao longo do corpo, cortando não mais profundo que a pele e evitando o ânus.
5. Faça dois cortes laterais com a tesoura em direção à cabeça do peixe para permitir uma abertura na incisão.
6. Prenda a pele de cada lado das incisões laterais à superfície de dissecação, inclinando os pinos para fora, afastando-se do corpo.
NOTA: As pontas dos pinos eram previamente esterilizadas com fogo com álcool.
3. Remoção do trato intestinal
NOTA: O trato intestinal deve ser visível como um tubo pálido e muito fino sobre os outros órgãos.
1. Esterilize as pinças com chama e depois utilize-as para remover todo o trato intestinal (tipicamente de 12 a 15 mm de comprimento). Coloque o intestino em um tubo de homogeneização contendo contas de vidro (veja os passos 1.3.1–1.3.2) e 1 mL de 1x PBS ou LB, sobre gelo.
3. Homogeneização
1. Prepare os tubos de homogeneização antecipadamente despejando ~1,5 g de esferas de vidro de 1 mm em tubos de tampa roscada de 2 mL (preencha aproximadamente até a metade) e depois esterilize-os por autoclav.
2. Adicione 1 mL de LB estéril ou 1x PBS.
3. Depois que os intestinos do peixe-zebra foram adicionados (passo 1.2.3.1) aos tubos, parafuse as tampas bem apertadas e então fixe os tubos no homogeneizador de vórtice.
4. Homogeneize as amostras por 1 minuto na configuração máxima, depois esfrie-as no gelo por 1–2 minutos. Repita esse ciclo de homogeneização mais uma vez para uma homogeneização completa. Nota: Vários métodos alternativos para homogeneização também funcionam.
4. Quantificação dos níveis de colonização intestinal
1. Preparar tubos (sejam pequenos tubos de ensaio de vidro ou tubos microcentrífugas de 1,5 mL) para a diluição serial do homogeneado, adicionando 900 μL de LB ou 1x PBS a cada tubo. Para cada peixe, prepare 5–6 tubos e faça diluições seriadas de 10 vezes do homogeneado intestinal, adicionando 100 μL de homogeneado ao primeiro tubo, vórtizando para misturar e depois adicionando 100 μL do primeiro tubo para o segundo.
2. Repita este procedimento até que todas as diluições estejam preparadas.
3. Placa de 100–200 μL de cada diluição em placas de ágar LB contendo 100 μg/mL de estreptomicina (se usar cepas resistentes à estreptomicina) e 40 μg/mL de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido). Incube as placas a 30 °C por 16–18 horas.
4. Após a incubação durante a noite, contar as colônias de V. cholerae nas placas, seja usando um contador automático de colônias ou contando manualmente as colônias; É útil marcar as colônias contadas com uma ponta de marcador.
5. Determinar a UFC por intestino de peixe multiplicando a contagem de placas pelo fator de diluição da suspensão, levando em conta o volume que foi placado.