Colonização Intestinal e Indução de Diarreia por Vibrio cholerae em Peixe-Zebra Adulto

Resumo

Fonte: Nag, D., et.al. Quantificação da colonização e diarreia por Vibrio cholerae no modelo adulto de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a inoculação de peixes-zebra adultos com uma cepa patogênica de Vibrio cholerae para estudar a colonização intestinal e os desfechos da doença. Mostra como toxinas bacterianas prejudicam a integridade intestinal, levando a vazamento de líquido, secreção de muco e diarreia aquosa antes que os peixes estejam preparados para análise adicional.

Protocolo

1. Inoculação de peixe-zebra por imersão
   NOTA: Esse método de exposição se assemelha ao curso natural da infecção.
   1. Preparação do Vibrio cholerae
      1. Inocule 5 mL de caldo de lisogênia (LB) com uma colônia isolada de V. cholerae a partir de uma placa LB e incube a 37 °C com agitação (180 rpm) por 6–8 horas (cultura durante a noite).
      2. Inocule 25 mL de meio LB fresco autoclavado em um frasco cônico de 250 mL com 50 μL da cultura acima durante a noite. Incube-a por 16–18 horas a 37 °C com agitação (150 rpm).
      3. Leia a densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de uma diluição de 1/10 da cultura durante a noite para estimar o número de bactérias por mL (o OD₆₀₀ = 1 é ~10⁹ CFU/mL).
      4. Colhe as células por centrifugação a 6.000 g por 10 minutos. Remova o meio com uma pipeta ou despeje em uma solução desinfetante. Resuspenda as células em PBS estéril até a concentração desejada, tipicamente entre 1 x 10⁷ a 1 x 10¹⁰ por ml de PBS.
         NOTA: Aqui, chamamos água de osmose reversa autoclavada contendo 60 mg/L de sais marinhos como água de infecção estéril.
   2. Inoculação e incubação
      1. Coloque quatro ou cinco peixes-zebra em um béquer de 400 mL contendo 200 mL de água estéril para infecção.
      2. Adicione 1 mL de V. cholerae para obter a concentração desejada de infecção (tipicamente 5 x 10⁴ a 5 x 10⁷ CFU/mL) em 200 mL de água para infecção.
      3. Cubra o béquer com uma tampa perfurada para evitar que o peixe pule para fora; o topo de uma caixa de ponta de 200 μL funciona bem para isso.
      4. Rotule cada béquer e coloque-os em uma incubadora de frente de vidro ajustada a 28 °C durante toda a duração do experimento.
   3. Procedimento para exposição transitória
      NOTA: Uma exposição transitória a V. cholerae (tipicamente 6 horas) seguida da remoção das bactérias inoculadoras é útil para estudar a transmissão e para a quantificação mais precisa das bactérias excretadas.
      1. Após 6 horas de exposição, despeje a água do béquer através de uma rede de arrastão para coletar os peixes. Descarte a água infectada em um recipiente de água sanitária para matar a V. cholerae.
      2. Coloque o peixe removido em um béquer com 200 mL de água estéril para infecção. Deixe o peixe nadar nessa água limpa por 5 minutos para remover as bactérias da superfície do peixe.
      3. Repita o procedimento com rede e coloque o peixe em um novo béquer com 200 mL de água estéril para infecção. Mantenha os peixes nesse béquer durante todo o experimento.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Instrumento
Incubadora	NUAIRE, Plymouth, MN	Fluxo Automático
Materiais
Béqueres de vidro de 400 ml	Pyrex
Tampas perfuradas	Suporte para micropontas com furos da caixa de ponteiras
Sistema de Aquário	Aquaneering, San Diego, CA
Purificador de Água RO	Aqua FX	TK001
Rede de pesca	Marina
Alimento para peixes	Tetra-nadadeira
Placa de Petri	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
Tubo centrífugo de 1,5 ml	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
Tubos de ensaio	Pyrex	9820
Micropipetas	Sartorius Biohit, Göttingen, Alemanha	M1000/M200/M20
Dicas	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
LB Medium
Trípton	BD em Biociências, San Jose, CA	211705
Extrato de levedura	BD em Biociências, San Jose, CA	212750
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD em Biociências, San Jose, CA	214010