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1. Preparação de placas de meio de crescimento de nematoides (NGM) para testar os efeitos de diferentes bactérias na permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans (C. elegans)
- Coloque 1,25 g de peptona, 1,5 g de NaCl, 8,5 g de ágar, um agitador magnético e 487,5 mL de água destilada em uma garrafa de vidro de 500 mL.
- Misture bem a mistura, faça o autoclave por 15 minutos a 121 °C e esfrie a mistura a 55 °C em banho-maria por 30 minutos.
- Retire o meio do banho-maria, adicione os componentes (0,5 mL de 1 M CaCl2, 0,5 mL de colesterol, 0,5 mL deMgSO 4, 12,5 mL de KPO4) ao NGM e misture bem.
NOTA: Todos os componentes individuais devem ser autoclavados, exceto o colesterol (dissolvido em etanol absoluto), e cada etapa experimental deve ser realizada em uma bancada limpa. - Distribua 20 mL de NGM em cada placa de Petri de 90 x 15 mm e deixe o ágar solidificar em uma bancada limpa à temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C). As placas NGM podem ser armazenadas por até um mês a 4 °C.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As placas NGM usadas para a coloração com FITC-dextrano (Fluoresceína isotiocianato-dextran) foram preparadas. 10 mL de NGM foram distribuídos para cada placa de Petri de 60 x 15 mm e deixados solidificar em uma bancada limpa à temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C). - Remova a cultura bacteriana da geladeira de 4 °C e faça um vórtice completo na cultura antes de espalhá-la nas placas NGM.
- Adicione um total de 800 μL da cultura bacteriana a cada placa nova de GNM e deixe as placas secarem em uma incubadora a 20 °C durante a noite.
NOTA: Para o primeiro experimento (Figura 1), foram preparadas duas placas NGM com E. coli OP50, uma placa NGM com P. aeruginosa PAO1 e uma placa NGM com E. faecalis KCTC3206. Para o segundo experimento (Figura 2), foram preparadas duas placas NGM com E. coli vivo OP50, uma placa NGM com P. aeruginosa vivo PAO1 e uma placa NGM com P. aeruginosa PAO1 inativado por calor.
3. Preparação de C. elegans sincronizados com a idade
- Cultive minhocas em uma placa sólida de NGM e alimente-as com E. coli OP50 até atingir a população desejada.
- Sincronize os ovos usando o método de postura cronometrada ou o tratamento com solução branqueante
4. Tratamento de Bactérias e Alimentação com FITC-dextrano
- Incube os ovos sincronizados com a idade a 20 °C por 64 horas em placas NGM suplementadas com E. coli viva OP50 como alimento.
- Lave as larvas de L4 sincronizadas com a idade com um tampão S e transfira-as (mais de aproximadamente 500 vermes) para as placas NGM de tratamento contendo diferentes bactérias e produtos químicos. Incube-as a 20 °C por 48 horas.
NOTA: O tempo de tratamento pode variar de 24 a 72 horas, de acordo com as bactérias e produtos químicos utilizados. O efeito terapêutico ou preventivo do DIM também pode ser avaliado pré-tratando os vermes com patógenos e depois tratando com DIM (o efeito terapêutico) ou pré-tratando os vermes com DIM e depois com patógenos (efeito preventivo). - Para preparar as placas suplementadas com FITC-dextran, misture 2 mL de E. coli OP50 inativada por calor com 4 mg de FITC-dextran. Depois, divida 100 μL da mistura FITC-dextrano e E. coli OP50 em vinte placas de ágar NGM frescas (60 mm x 15 mm) e deixe as placas secarem por 1 hora em uma bancada limpa.
NOTA: A concentração final de FITC-dextrano em cada placa NGM será de 20 μg/mL. - Prepare cinco placas NGM contendo E. coli OP50 sem FITC-dextrano para o tratamento de controle do veículo. Para isso, divida 100 μL de E. coli OP50 inativado por calor em cada placa de ágar NGM fresca (60 mm x 15 mm) e deixe as placas secarem por 1 hora em uma bancada limpa.
NOTA: Para cada experimento independente, são necessárias quinze placas NGM suplementadas com FITC-dextran e cinco placas NGM sem FITC-dextran. - Após 48 horas de tratamento (do passo 7.2), lave as minhocas com S-buffer, transfira as minhocas para as placas suplementadas com FITC-dextrano e para as placas NGM sem FITC-dextran, e incube as placas durante a noite (14–15 h).
NOTA: Para cada grupo de tratamento, são necessárias 5 réplicas da coloração com FITC-dextrano (ou alimentação de controle veicular). - Lave as minhocas com S-buffer e deixe-as rastejar na placa de ágar NGM fresca por 1 hora.
NOTA: Para cada experimento independente, são necessários um total de 20 placas NGM novas. Nessa etapa, você pode usar a placa NGM complementada com ou sem E. coli OP50. - Adicione 50 μL de solução de formaldeído a 4% em cada poço de uma placa preta de fundo plano de 96 poços. Transfira aproximadamente 50 vermes de cada placa NGM para cada poço para medições de fluorescência. Após 1 a 2 minutos, remova completamente todo o formaldeído de cada poço e adicione 100 μL de meio de montagem para revestir os poços.
NOTA: A solução de formaldeído (4%) é usada para imobilizar e fixar as minhocas. Para cada grupo de tratamento, 5 poços (5 replicados) são usados para análise de imagem.
5. Imagem de C. elegans com o Sistema de Imagem de Opereta e Determinação da Permeabilidade Intestinal Medindo a Captação de Fluorescência de FITC-dextrano
NOTA: A estereomicroscopia fluorescente pode ser usada para análise de imagens em vez do sistema Opereta.
- Capture imagens de fluorescência e meça a intensidade da fluorescência usando o Sistema de Imagem de Alto Conteúdo Operetta e analise as imagens com o software Harmony.
- No software Harmony, pressione o ícone Abrir tampa para abrir a tampa e colocar a placa na máquina.
- Defina os parâmetros.
- Clique em Configurar, selecione o tipo de placa (fundo plano de Corning de 96 poços) e adicione os canais (campo claro e canais EGFP).
- Ajuste o layout. Vá até a seleção de Layout, depois selecione Track e ajuste os parâmetros (primeira imagem em 1 μm, número de planos é 10, distância é 1 μm).
- Selecione um dos poços de tratamento e um campo de captura e pressione Teste para verificar se as imagens estão satisfatórias na seção do experimento Executar .
- Se as imagens estiverem satisfatórias, volte à seção de Configuração e pressione o ícone Reiniciar no final da tela. Depois, selecione todos os poços-alvo e um número adequado de campos de captura.
- Vá para Executar experimento novamente e insira o nome da placa, depois pressione Start para iniciar o processamento.
- Para medir a intensidade da fluorescência, vá na seção de análise de imagem e insira a imagem. Encontre a célula escolhendo o canal EGFP (proteína fluorescente verde aprimorada) e o método B. Ajuste o limiar comum para 0,5, área para >200μm 2, fator de divisão para 3,0, limiar individual para 0,18 e contraste para mais de 0,18. Depois, calcule as propriedades de intensidade e escolha a média como saída. Pressione o ícone Aplicar para salvar a configuração.
- Vá para a seção de Avaliação para medir a intensidade obtendo um mapa de calor e uma tabela de dados. Defina o parâmetro de leitura para Células — Média da Célula de Intensidade EGFP — Média por Poço e inicie a avaliação.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. - Para extrair os dados do Operetta, clique no botão Configurações e escolha Gerenciamento de dados.
- Escolha Escrever arquivamento, depois abra a navegação e selecione o arquivo.
- Para selecionar o arquivo, clique no sinal + pequeno no canto esquerdo, depois clique em Medição e escolha Nome da placa.
- Selecione o arquivo e clique em OK.
- Selecione o caminho para salvar o arquivo clicando no sinal Navegar no caminho ativo.
- Clique em Iniciar para salvar o arquivo de dados.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
