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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.
1. Preparação de culturas de Salmonella Typhimurium ΔAroA para gavage oral de camundongos
- A partir de um estoque congelado de glicerol de S. Typhimurium ΔAroA, prepare uma placa de estrias usando ágar Luria-Bertani (LB agar) contendo 100 μg/mL de estreptomicina com um laço inoculante estéril. Incube durante a noite a 37 °C. Placas de estrias podem ser armazenadas até uma semana a 4 °C.
- Um dia antes da infecção, prepare o antibiótico dissolvendo 0,5 g de estreptomicina em 2,5 mL de água. Após esterilizar a solução de estreptomicina com filtro, faça o gavage oral dos camundongos usando uma agulha de 22G com ponta de bulbo e 1 mL de seringa com 100 μL de solução de estreptomicina (20 mg de estreptomicina/dose). Usando um alça inoculante, inocule 3 mL de caldo LB (50 μg/mL estreptomicina) em um tubo de cultura com uma única colônia. Incubar a cultura de Salmonella aeróbicamente a 37 °C durante a noite com agitação a 200 Revolucions Por Minuto (RPM).
- No dia da infecção, prepare a dose final realizando 2 diluições consecutivas de 1/10 de culturas de Salmonella durante a noite em soro tampão de fosfato estéril (PBS). Isso resultaria em um inoculo de 100 μL contendo aproximadamente 3 x 106 Unidades Formadoras de Colônias (CFU).
- Usando uma agulha gavage de 22G com ponta de bulbo e uma seringa de 1 mL, faça o gavage de cada camundongo com 100 μL da Salmonella preparada.
NOTA: Prepare culturas de Salmonella usando técnicas assépticas. A concentração final de inoculação de Salmonella pode ser verificada por diluições seriadas em ágar LB com estreptomicina.
2. Avaliação das cargas de Salmonella nos tecidos
- Prepare microtubos de fundo arredondado com 2 mL de cofre com fechadura e 1 mL de PBS estéril e uma esfera de aço inoxidável autoclavada. Antepese os tubos antes da coleta do tecido.
- Ressecar os tecidos cecal e esplênico de camundongos eutanasiados por exposição ao dióxido de carbono. Colete tecido de animais individuais em tubos separados. Pese os tubos para determinar o peso dos tecidos.
- Homogeneize usando um aparelho de misturador por 15 minutos a 30 Hz. Transfira 900 μL de PBS por poço em um megabloco de 96 poços de 2 mL. Pipete 100 μL de tecido homogenados no primeiro poço, mistura bem e realiza diluições seriadas adicionando 100 μL aos poços subsequentes até obter uma diluição de 10⁻⁶. A placa 10 μL de cada diluição triplica sobre ágar LB contendo 100 μg/mL de estreptomicina.
- Conte e multiplique a média da CFU por um fator de 100, já que 10 μL da amostra de 1000 μL foram placados, e o fator de diluição apropriado. Divida o peso total da UFC do tecido pelos pesos do tecido para determinar a UFC por grama de tecido.
NOTA: Mantenha todas as amostras no gelo ou a 4 °C durante o processamento do tecido. Use ponteiras de pipeta de orifício largo ao realizar diluições seriadas com homogeneados de tecido. Prepare o megabloco de 96 poços contendo PBS com antecedência.