Preparação do inóculo de Gardnerella vaginalis para modelar infecções urinárias recorrentes em camundongos

Resumo

Fonte: O'Brien, V.P. et al. Infecção urinária recorrente de Escherichia coli desencadeada pela exposição à bexiga de Gardnerella vaginalis em camundongos. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a preparação de um inóculo de Gardnerella vaginalis para estabelecer um modelo murino de infecção urinária recorrente.

Protocolo

1. Prepare o inoculo para Gardnerella vaginalis
   NOTA: Todos os passos são realizados em uma câmara anaeróbica. Os tempos ideais de incubação da cultura variam entre diferentes cepas de G. vaginalis, com algumas cepas entrando na fase estacionária e até começando a morrer mais rapidamente que outras. Assim, os tempos de incubação devem ser determinados empiricamente para uma determinada cepa antes de realizar experimentos em camundongos. Não se sabe se outras/todas as cepas de G. vaginalis desencadearão os mesmos efeitos neste modelo.
2. Streak G. vaginalis coagem do caldo congelado a -80 °C para um prato NYCIII (sem antibióticos). Incube a placa a 37 °C anaeróbicamente por 24 horas.
3. Na câmara anaeróbia, inocule 5 mL de meio anaeróbico NYCIII com um laço de 1 μL de células (uma única colônia é insuficiente) da placa NYCIII e incube a cultura estaticamente a 37 °C sob condições anaeróbicas por 18 horas. Não inclua antibióticos no meio de crescimento.
4. Determine o OD⁶⁰⁰ da cultura usando um espectrofotômetro
   1. Centrifuge um volume definido (X) de cultura a 9600 × g por 1 minuto e aspire o meio. Calcule o volume (Y) de soro salino tamponado com fosfato (PBS) para re-suspender o pellet e alcançar a densidade óptica (OD) do inoculo desejada e alcançar 10⁸ unidades formadoras de colônias (CFU) em 50 μL usando a seguinte equação: X mL × ODculture = Y mL × ^{OD inóculo} , resolva para YY = (X ml × ODculture) / ^{OD inoculum}
      NOTA: O ^inóculo de OD para JCP8151B^SmR é 5, mas isso deve ser determinado empiricamente para outras cepas de G. vaginalis . Por exemplo, se centrifugar 3 mL de uma^{JCP8151B SmR} durante a noite com cultura líquida ODculture = 2,0: Y = (3 mL × 2,0) / 5,0; portanto, resuspenda o pellet em 1,2 mL PBS.
   2. Ressuspenda o pellet bacteriano em PBS até a concentração desejada. Dilua e placue serialmente o inóculo para determinar a dose real de inóculo utilizada em cada experimento. Não confie apenas nos valores OD.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Glicose	Sigma	G7528	Para o meio de crescimento de G. vaginalis da NYCIII
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-ácido etanosulfônico (HEPES)	Cellgro	25-060-CL	Para o meio de crescimento de G. vaginalis da NYCIII
Cloreto de sódio	Sigma	S3014	Para o meio de crescimento de G. vaginalis da NYCIII
Peptona proteose #3	Fisher	DF-122-17-4	Para o meio de crescimento de G. vaginalis da NYCIII
Extrato de levedura	Fisher	DF0127-17-9	Para o meio de crescimento de G. vaginalis da NYCIII
Espectrofotômetro	BioChrom	80-3000-45	Medindo a bactéria OD600
Estreptomicina	Gibco	11860038	Adicionar às placas seletivas NYCIII de G. vaginalis (1 mg/mL)