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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.
1. Inoculação intranasal de camundongos com Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) cultivado em biofilme.
- Compre camundongos e use-os na idade desejada.
NOTA: Ratos de 3 a 4 meses são preferidos para modelar hospedeiros jovens, e camundongos de 21 a 24 meses podem ser usados para modelar idosos >65 anos de idade. Os dados apresentados aqui são de C57BL/6 camundongos machos. - Descongele as alíquotas bacterianas cultivadas em biofilme no gelo e centrifuge a 1.700 × g por 5 minutos. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet, lave as bactérias ressuspendendo o pellet em 1 mL de soro salino tamponado com fosfato (PBS) e centrifuge novamente a 1.700 × g por 5 minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet no volume necessário para atingir a concentração desejada (procure 5 ×10 unidades formadoras de 6 colônias (UFC)/10 μL para inoculação intranasal). Confirme as quantidades de bactérias administradas ao colocar o inóculo preparado em placas de ágar sanguíneo.
- Inocule os camundongos intranasal com 5 × 106 UFC pipeteando 5 μL do inóculo diluído em cada naris. Certifique-se de segurar os camundongos firmemente, estabilizando a cabeça, até que o volume seja inalado (normalmente em segundos após pipetar o volume nas narinas). Realize essa etapa na ausência de anestesia para evitar aspiração pulmonar do inóculo.
2. Infecção viral pelo vírus influenza A (IAV)
- Às 48 horas após a inoculação intranasal com S. pneumoniae, descongele a cepa IAV de interesse no gelo.
NOTA: Os dados apresentados aqui são de uma cepa adaptada a camundongos do vírus influenza A A/PR/8/34 H1N1, obtida por meio de troca colaborativa. - Uma vez que o vírus tenha descongelado, dilua-o no PBS até a concentração desejada; procurar 20 unidades formadoras de placas (PFU)/50 μL para infecção intratraqueal e 200 PFU/10 μL para infecção intranasal. Para grupos de falsos infectados e apenas bactérias, use PBS para inocular os camundongos.
- Coloque lubrificante oftálmico nos olhos dos camundongos antes da anestesia. Anestesie os camundongos usando isoflurano a 5% e confirme a anestesia com uma beliscada firme no dedo do pé.
- Uma vez anestesiado, retire-o da câmara de isoflurano e imediatamente infecte os camundongos anestesiados com 50 μL (20 PFU) de IAV intratraquealmente usando pinças sem lesão para puxar a língua da boca e pipetar o volume de líquido pela traqueia.
- Coloque os camundongos em uma gaiola separada e monitore até a recuperação completa (eles conseguem manter a reclinação esternal [conseguem deitar eretos no peito]).
- Após a recuperação, inocule imediatamente os camundongos intranasal com 10 μL (200 PFU) de IAV usando o método de inoculação na etapa 1.3.
- Camundongos domésticos que passaram por infecção bacteriana e viral única ou dupla com o mesmo grupo de infecção e se separaram dos outros grupos.