Processamento de Tecidos Infectados para Enumeração Bacteriana em um Modelo de Co-Infecção de Camundongos

Abstract

Fonte: Lenhard, A., et al. Um modelo camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença agravada pela idade. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o processamento dos pulmões de um camundongo co-infectado por uma bactéria patogênica e um vírus. A trituração, homogeneização e blindagem do tecido pulmonar permitem quantificar a carga bacteriana, indicando disseminação bacteriana para os pulmões e gravidade da doença.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.

1. Processamento de tecidos infectados para enumeração bacteriana

1. Coleção pulmonar
   1. Usando tesouras de dissecação, corte as laterais da caixa torácica exposta e puxe suavemente as costelas para cima em direção à cabeça do camundongo para expor o coração. Insira uma agulha de 25 G presa a uma seringa de 10 mL pré-preenchida com soro salino tamponado com fosfato (PBS) no ventrículo direito e comece a perfusar lentamente. Procure por branqueamento pulmonar como indicador de perfusão bem-sucedida. Lave lentamente para evitar quebrar o tecido pulmonar.
   2. Levante o coração com a pinça e faça um corte para separar os pulmões do coração. Depois de separados, recolha todos os lóbulos do pulmão com a pinça e enxágue em um recipiente com PBS estéril para remover qualquer sangue residual. Em uma placa de Petri, triture os pulmões em pedaços pequenos e misture bem. Remova metade da mistura pulmonar para determinar as unidades formadoras de colônias bacterianas (UFC) ou unidades formadoras de placas virais (PFU) e coloque-a em um tubo de fundo arredondado de 15 mL, pré-preenchido com 0,5 mL de PBS para homogeneização.
      NOTA: É importante não usar lóbulos diferentes do mesmo pulmão para as diversas avaliações. Em vez disso, todos os lóbulos devem ser minados, bem misturados e separados igualmente para as diferentes avaliações.
2. Para homogeneizar o tecido coletado, primeiro limpe a sonda homogeneizadora colocando-a em etanol a 70% e ligando o homogeneizador a 60% de potência por 30 segundos. Repita o passo em água estéril por 10 segundos. Homogeneize cada tecido por 1 minuto. Limpe a sonda homogeneizadora em água estéril entre cada amostra e em um tubo fresco com 70% de etanol entre cada órgão e grupo de amostra.
3. Enumeração dos números bacterianos
   1. Uma vez que todos os órgãos tenham sido colhidos e homogeneizados, as placas são diluídas em série nas placas de ágar sanguíneo. Para calcular a UFC total, use 10 μL para laminar e anote o volume final em mL para cada amostra. Incube durante a noite a 37 °C/5% de CO₂.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringas descartáveis BD com pontas Luer-Lok (1 mL)	Fisher	14-823-30
Tesoura delicada de dissecação Fisherbrand	Fisher	08-951-5	Instrumentos usados para a colheita
Fisherbrand dissecando pinças de tecido	Fisher	13-812-38	Pinça para colheita
Seringas estéreis Fisherbrand para uso único (10 mL)	Fisher	14-955-459