Geração de uma monocamada colonoide humana com função barreira para estudar as interações hospedeiro-patógeno

Abstract

Fonte: In, J. G., et al. Monocamadas colonoides humanas para estudar interações entre patógenos, comensais e epitélio intestinal do hospedeiro. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra o procedimento para cultivar células epiteliais derivadas do cólon em um sistema Transwell revestido de colágeno para gerar uma monocamada produtora de muco que modela a barreira intestinal e possibilita estudos de interação hospedeiro-patógeno.

Protocol

1. Revestimento da suspensão enteroide/colonoide

1. Se os inserts revestidos foram armazenados a 4 °C, equilibre-se em uma incubadora de cultura de tecidos com 37 °C/5% de CO₂ por pelo menos 30 minutos antes da placagem celular.
2. Para cada inserto a ser placado, prepare 1 mL de meio de expansão morno (entre 25-37 °C) e adicione 10 μM Y-27632 e 10 μM CHIR 99021.
   NOTA: O EM é composto por DMEM Avançado (Meio Eagle Modificado de Dulbecco) /F12 contendo B27 (1x), meio condicionado com 50% de WNT3A, meio condicionado com RSPO1 com 15%, meio condicionado por Noggin com 10%, 50 ng/mL EGF humano (Fator de Crescimento Epidérmico), 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, coquetel antibiótico/antimicótico (1x), 10 mM HEPES (N-(2-Hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanossulfônico)), Dipeptídeo L-alanil-L-glutamina (1x) e penicilina-estreptomicina (1x) (veja Tabela de Materiais).
3. Aspire o meio de lavagem do tubo contendo o pellet celular e resuspenda em um volume de EM suficiente para obter pelo menos 100 μL/insert.
4. Aspire a solução IV de colágeno de cada inserto e lave duas vezes com 150 μL do meio de lavagem por inserção.
5. Pipete 600 μL de EM no espaço abaixo de cada inserção.
6. Pipete 100 μL de suspensão de célula em cada inserção.
7. Devolva a placa ao incubador de cultura de tecidos e deixe intocada por pelo menos 12 horas.
   NOTA: Evite sacudir ou inclinar bruscamente a placa para evitar a distribuição desigual dos fragmentos de colonoide na membrana do inserto.
8. Monitore a fixação e a expansão da célula para formar uma monocamada confluente colocando a placa em um microscópio de luz com contraste de fase sob uma lente objetiva 2,5x-10x.
9. Após 1-2 dias, a maioria dos fragmentos deve aderir à matriz de colágeno. Renove o meio de cultura e interrompa o tratamento com Y-27632 e CHIR 99021. Continue renovando o meio a cada 2-3 dias até que conflua. A confluência geralmente é alcançada em 7 a 10 dias.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanediol	Sigma	T4661	Base tris, Componente do buffer de lise
A-83-01	Tocris	2939	Inibidor ALK4/5/7
Ácido acético, glacial	Fisher Scientific	A38
DMEM/F12 Avançado	Tecnologias de Vida	12634-010	Componente do meio de cultivo
Coquetel antibiótico/antimicótico	Invivogen	ANT-PM-2	Primocin (100x)
B27, 50x	Tecnologias de Vida	17504-044	Componente do meio de cultivo
Inserções de cultura celular	Corning	3470	Transwell, membrana PET, poro de 0,4 μm, placa de 24 poços
CHIR 99021	Tocris	4423	Inibidor GSK3β
Colágeno IV, da placenta humana	Sigma	C5533
Solução de Colheita de Organoides Cultrex	Trevigen	3700-100-01	Despolimeriza matriz de membrana basal
Etanol, absoluto	Pharmco	111000200
GlutaMAX	Tecnologias de Vida	35050-061	Dipeptídeo L-alanil-L-glutamina, 200 mM
Linha celular HEK293T/Noggin-Fc	Laboratório van den Brink, Instituto Tytgat de Pesquisa do Fígado e Intestino		Para produção de meio condicionado a Noggin
HEK293T/RSPO1-Fc-HA	Trevigen	3710-001-K	Para a produção de meio condicionado Rspondin-1
HEPES, 1 M	Tecnologias de Vida	15630-080	Componente do meio de cultivo
Fator de crescimento epidérmico humano (EGF)	Sistemas de P&D	236-EG-01M	Componente do meio de cultivo
Microscópio óptico de cultura celular invertida	Olympus	CKX51
Linha celular L-WNT3A	ATCC	CRL-2647	Para produção de meio condicionado Wnt3a
Matrigel, fator de crescimento reduzido	Corning	356231	Matriz de membrana basal para cultura 3D
Raspador de mini célula	United BioSystems	MCS-200
Anticorpo MUC2, monoclonal de camundongo	Abcam	ab11197	Uso em 1:100 para imunocoloração, 1:500 para imuno-absorção
Partículas lentivirais do shRNA MUC2	GE Dharmacon	RHS4531	SHRNA lentiviral GIPZ, ID: 4583
Agitador orbital	Instrumentos de Concessão	PSU-10i
Penicilina-estreptomicina, 100x	Tecnologias de Vida	15140-122	Componente do meio de cultivo
Sondador sonda com microponta	Branson Ultrassom	450
Coquetel inibidor de protease para células de mamíferos	Sigma	P8340	Componente do buffer de lise
SB 202190	Tocris	1264	Inibidor de MAPK p38
Cloreto de sódio	Sigma	S3014	Componente do buffer de lise
Dexoicocolato de sódio	Sigma	D6750	Componente do buffer de lise
Dodecilsulfato de sódio	Sigma	L3771	Componente do buffer de lise
TrypLE Express, 1x	Tecnologias de Vida	12605-010	Tripsina, para digerir fragmentos enteroides/colonoides
Anticorpo vinculina, monoclonal de coelho	Abcam	ab129002	Use a 1:1000 para imunoblotting
Água, grau de cultura tecidual, estéril filtrado	Corning	25-055
Y-27632	Tocris	1254	Inibidor de RhoA/ROCK