Geração de Esferoplastos a partir de Bactérias Gram-Negativas

Resumo

Fonte: Figueroa, D. et al. Produção e visualização de esferoplastos e protoplastos bacterianos para caracterizar a localização de peptídeos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra a preparação de esferoplastos a partir de bactérias gram-negativas em forma de bastonete. Bactérias são cultivadas na presença de um antibiótico para formar filamentos alongados. Esses são lavados com uma solução hipertônica e tratados com um tampão de lise para remover a parede celular externa. O tratamento hipotônico forma esferoplastos, que são estabilizados com uma solução isotônica resfriada e armazenados em condições frias.

Protocolo

1. Preparação da Solução

NOTA: Prepare as soluções descritas nos passos 1.1–1.9 para produzir esferoplastos de Escherichia coli (E. coli )

1. Prepare 1 M de cloridrato de tris(hidroximetil)aminometano (Tris-Cl), pH 7,8, dissolvendo 10,34 g de Tris·HCl e 4,17 g de tris(hidroximetil)aminometano (Tris·OH) em 50 mL de água destilada (dH₂O) em um frasco de 125 mL. Esterilize filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com membrana de 0,2 μm e armazene em um tubo cônico à temperatura ambiente.
2. Prepare a solução A (20 mM cloreto de magnésio (MgCl₂), 0,7 M sacarose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) dissolvendo 0,10 g de MgCl₂ (95,2 g/mol) e 11,98 g de sacarose (342,3 g/mol) em 25 mL dH₂O em um frasco de 125 mL. Adicione 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e ajuste o volume para 50 mL. Esterilize filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com membrana de 0,2 μm e armazene em um tubo cônico à temperatura ambiente.
3. Prepare a solução B (10 mM de MgCl₂, 0,8 M de sacarose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) dissolvendo 0,05 g de MgCl₂ (95,2 g/mol) e 13,69 g de sacarose (342,3 g/mol) em 25 mL de dH₂O em um frasco de 125 mL. Adicione 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e ajuste o volume para 50 mL. Esterilize filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com membrana de 0,2 μm e armazene em um tubo cônico à temperatura ambiente.
4. Prepare 0,8 M de sacarose dissolvendo 13,69 g de sacarose (342,3 g/mol) em 50 mL dH₂O em um frasco de 125 mL. Esterilize filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com membrana de 0,2 μm e armazene em um tubo cônico à temperatura ambiente.
5. Prepare 5 mg/mL de desoxirribonuclease I (DNase I) dissolvendo 0,015 g de DNase I em 3 mL de dH₂O em um frasco de 50 mL. Esterilize filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com membrana de 0,2 μm. Solução aliquota em tubos microfuge e armazenada a −20 °C.
6. Prepare 0,125 M de ácido etilenediadinatetraacético (EDTA), pH 8,0, dissolvendo 0,698 g de EDTA dissódico diidrato (372,2 g/mol) em 15 mL dH₂O em um frasco de 125 mL. Esterilize filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com membrana de 0,2 μm e armazene em um tubo cônico à temperatura ambiente.
7. Prepare 600 μg/mL de cefalexina dissolvendo 0,03 g de hidrato de cefalexina (365,404 g/mol) em 50 mL de dH₂O em um frasco de 125 mL. Esterilize filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com membrana de 0,2 μm e armazene em um tubo cônico a 4 °C.
8. Prepare 5 mg/mL de lisozima dissolvendo 0,015 g de lisozima em 3 mL de dH₂O em um frasco de 50 mL. Esterilize filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com membrana de 0,2 μm. Solução aliquota em tubos microfuge e armazenada a −20 °C.
9. Prepare 3% de c/v de Caldo de Soja Tripticase (TSB) dissolvendo 30 g de TSB em 1 L de dH₂O em um frasco de 2 L. Aliquota a solução em frascos contendo 25 mL ou 100 mL de TSB para serem usados na preparação de esferoplastos de E. coli ou protoplastos de B. megaterium, respectivamente. Frascos de autoclave para esterilizar o meio líquido. O TSB estéril pode ser armazenado tanto à temperatura ambiente quanto a 4 °C.
10. Prepare a solução C (1 M de sacarose, 0,04 M de maleato, 0,04 M de MgCl₂, pH 6,5) dissolvendo 34,23 g de sacarose (342,3 g/mol), 0,46 g de ácido maléico (116,07 g/mol) e 0,38 g de MgCl₂ (95,21 g/mol) em 100 mL de dH₂O em um frasco de 250 mL. Ajuste o pH para 6,5. Esterilize filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com membrana de 0,2 μm e armazene em um tubo cônico à temperatura ambiente.

2. Preparação da Cultura Noturna

NOTA: Realize as seções 2-3 usando técnicas estéreis apropriadas. Se desejado, uma cepa bacteriana pode conter um plasmídeo para resistência a antibióticos e reduzir a potencial contaminação. Se estiver usando uma cepa com resistência a antibióticos, adicione os antibióticos necessários nos passos 2.1 e 3.1–3.2.

1. Prepare uma cultura durante a noite retirando uma única colônia de bactérias usando uma ponta de pipeta estéril e colocando-a em um tubo de cultura de 14 mL contendo 2–3 mL de 3% de TSB. Incubar a 37 °C, enquanto agita por 16–21 horas.

3. Preparação de esferoplastos Gram-negativos de E. coli

1. Em um frasco de 250 mL, dilua a cultura durante a noite 1:100 em volume de 25 mL de 3% w/v TSB e incube a solução bacteriana a 37 °C, agitando por aproximadamente 2,5 horas até que a solução atinja uma densidade óptica de 0,5–0,8 a 600 nm. Meça a densidade óptica usando um espectrofotômetro.
2. Em um frasco de 250 mL, dilua essa cultura 1:10 em 30 mL de 3% p/v TSB e incube a 37 °C, agitando por 2,5 h na presença de 60 μg/mL de cefalexina (347,4 g/mol) para produzir filamentos unicelulares de cerca de 50–150 μm de comprimento, que podem ser observados sob ampliação de 1.000X usando um microscópio óptico (Figura 1B).
3. Colhe os filamentos centrifugando a solução bacteriana a 1.500 x g, 4 °C por 4 minutos. Decante e descarte o sobrenadante, reservando a pastilha.
4. Lave os filamentos adicionando delicadamente 1 mL de sacarose 0,8 M, tomando cuidado para não mexer no pellet. Incube por 1 minuto e depois descarte o sobrenadante sem mexer na bola.
5. Adicione 150 μL de 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 μL de 5 mg/mL de lisozima, 30 μL de 5 mg/mL de DNase I e 120 μL de 0,125 M EDTA em sua ordem respectiva ao pellet e incube a solução em temperatura ambiente por 10 minutos.
6. Adicione 1 mL de solução A gradualmente, por mais de 1 minuto, à solução preparada em 3,5 minutos usando uma micropipeta, enquanto gira suavemente a solução à mão. Incube a solução por 4 minutos em temperatura ambiente.
7. Coloque 7 mL da solução B de 4 °C em dois tubos cônicos de 15 mL. Adicione quantidades iguais da solução preparada em 3,6 em cada um desses dois tubos. Centrifuge a solução a 1.500 x g, 4 °C por 4 minutos.
8. Usando uma pipeta sorológica, remova cuidadosamente todos, exceto 1-2 mL de sobrenadante, sem perturbar o pellet. Resuspenda o pellet pipetando suavemente para cima e para baixo usando uma micropipeta P1000. Verifique visualmente a formação dos esferoplastos observando a amostra com ampliação de 1.000X usando um microscópio óptico (Figura 1C).
9. Armazene os esferoplastos a -20 °C por até uma semana ou até que passem por 3 ciclos de congelamento-descongelamento.

Resultados

Figura 1: Imagens representativas de Escherichia coli. (A) bactérias E. coli , (B) cobras E. coli e (C) esferoplastos de E. coli. As imagens foram tiradas com ampliação de 100X.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloridrato de Trizma (Tris HCl)	Sigma	T3253
Trizma base (Tris OH)	Sigma	T1503
Cloreto de magnésio	Sigma	M8266
Sacarose	Sigma	S7903
Lisozima	Sigma	L6876
Desoxirribonuclease I	Sigma	D4527
Etilenediaminamina ácido tetraacético	Sigma	106361	Utilizou o Sigma 106361 no desenvolvimento original do protocolo; 106361 descontinuado com o ED2SS como substituto
Hidrato de cefalexina	Sigma	C4895
Caldo de soja BBL Trypticase	Fisher Scientific	B11768
Ácido maléico	Sigma	M0375
Filtro de Seringa Acrodisc 25 mm com membrana HT Tuffryn de 0,2 μm	Pall Corporation	4192