Estabelecimento de um modelo camundongo para infecção vaginal do grupo B por Streptococcus

Resumo

Fonte: Patras, K. A., Doran, K. S. Um modelo murino de colonização vaginal do grupo B por Streptococcus . J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a preparação e inoculação vaginal de uma fêmea de camundongo tratada com hormônios e com Streptococcus do Grupo B para modelar a infecção. Explica como cultivar e preparar as bactérias, administrar o inóculo no lúmen vaginal e garantir o sucesso da infecção.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.

1. Inoculação Vaginal com Streptococcus do Grupo B (GBS)

1. Um dia antes da inoculação, cultive uma cultura líquida de 5 ml durante a noite de uma cepa de GBS de interesse, como A909 (sorotipo Ia), em caldo Todd Hewitt (THB) a 37 °C.
2. Subcultura do GBS durante a noite em um volume 1:10 em THB fresco e incube a 37 °C. Faça crescer a bactéria até a fase média logaritarima (OD₆₀₀ = 0,4-0,5).

NOTA: Isso normalmente leva de 2 a 3 horas, dependendo da variedade de GBS.

3. Transfira a subcultura para um tubo cônico estéril de 15 ml e faça pastilhas de bactérias a 3.000 × g por 5 minutos. Aspire o sobrenadante. Ressuspenda o pellet bacteriano em 200 μl de soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS).
4. Usando o pellet ressuspenso, leve de 3 a 5 ml de PBS (1 ml por 10 camundongos) exatamente para o OD₆₀₀ = 0,4 em um novo tubo de cultura de 5 ml. Essa será uma concentração de ~ 1 × 10⁸ unidades formadoras de colônias (CFU)/ml. Transfira para um novo tubo cônico de 15 ml e refaça a pastilha a 3.000 × g por 5 minutos. Aspire o sobrenadante.
5. Ressuspenda o pellet em PBS a 1/10 do volume original. Por exemplo, se 3 ml de OD₆₀₀ = 0,4 foram comprimidos, então ressuspenda-os em 300 μl de PBS.

NOTA: Esta é a última suspensão bacteriana (~ 1 × 10⁹ UFC/ml) usada para inoculação animal.

6. Reserve 50 μl dessa suspensão para diluição serial e placagem em ágar THB para determinar o inoculo exato.
7. Inocule cada camundongo com 10 μl da suspensão bacteriana final para que 1 × 10^{7 CFU} seja administrado a cada camundongo.
   1. Para inocular, prenda o camundongo manualmente prendendo a pele solta na barba do pescoço entre o polegar e o indicador do condutor e então imobilizando a cauda.
   2. Extraia 10 μl do GBS em uma ponta de pipeta de carregamento em gel de 200 μl. Insira a ponta de 5 a 10 mm no lúmen vaginal e dispense os 10 μl de inóculo.
      NOTA: Ponteiras de carregamento em gel são preferidas em vez das ponteiras padrão de 200 μl para minimizar o risco de trauma ou lesão de órgãos, especialmente em camundongos mais jovens ou menores.
   3. Imediatamente após a inoculação, solte a barba do pescoço e eleve a parte traseira do rato, levantando o rato pela cauda e andando as patas dianteiras sobre uma superfície dura por ~ 1 minuto.
   4. Inspecione visualmente a abertura vaginal para detectar qualquer refluxo de inóculo. Se houver refluxo, uma nova ponta de pipeta pode ser usada para manipular ou ampliar a abertura vaginal, facilitando a absorção do refluxo para o lúmen. Além disso, o refluxo pode ser aspirado por uma pipeta e reinoculado.
      NOTA: Se for administrado agentes tópicos, organismos probióticos ou proteínas de interesse, pode ser administrado um volume de até 20 μl em um tampão fisiológico no trato vaginal.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ponteiras de pipeta com carregamento de gel de 200 μl	USA Scientific	1252-0610
Caldo Todd Hewitt	Hardy Diagnostics	7161C
Solução de Sal Tamponado com Fosfato da Dulbecco 1x	Corning	21-031-CV