Quantificação da Supressão de Biofilme Induzida por Enzimas em Bactérias Patógenas

Resumo

Fonte: Tay, S. B., et al. Perturbação Antivirulenta de Biofilmes Patogênicos usando lactonases modificadas para apagamento do quórum. J. Vis. Exp. (2016)

O vídeo demonstra um método para quantificar a biomassa de biofilme em uma bactéria patogênica, comparando controles não tratados com amostras tratadas com uma enzima que apaga quórum. A enzima interrompe a sinalização bacteriana durante a incubação inicial, reduzindo a adesão celular. Após lavagem e incubação adicional, poços de controle formam biofilmes densos, enquanto poços tratados apresentam formação reduzida. Um corante catiônico é usado para corar o biofilme, e a absorvância é medida para avaliar a biomassa.

Protocolo

1. Quantificação em violeta cristalino da formação de biofilmes em A. baumannii S1

1. Cultive uma cultura de 5 mL de Acinetobacter baumannii S1 (A. baumannii) em caldo de lisogênica (LB) (triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L) a 30 °C em uma incubadora agitada (220 rpm) por 16 horas.
2. Ajuste a cultura de A. baumannii S1 para uma densidade óptica desejada em 600 nm (OD₆₀₀) de 0,8. Usando uma placa de 96 poços, inocule a cultura bacteriana (diluição 1:100) em LB fresco contendo 10 μl de enzima GKL purificada (40 mg/ml); O volume final da nova cultura tem 100 μl.
3. Prepare também uma cultura de controle; Isso não conterá nenhuma enzima. Repita condições semelhantes para obter o número desejado de replicações.
4. Cubra o prato com uma tampa e coloque-o em um recipiente plástico lacrado de 10 L. Incube a placa a 30 °C por 3 horas antes de remover suavemente o substrato.
5. Adicione mais 100 μl de meio fresco LB ao poço e incube a placa por 21 horas a 30 °C.
6. Após o segundo período de incubação, remova delicadamente todo o meio. Lave a célula da bactéria planctônica com 200 μl de água estéril. Certifique-se de que haja apenas uma perturbação mínima nas células durante a lavagem.
7. Adicione 100 μl de solução de violeta cristalina a 1% em cada poço e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Remova a solução de violeta cristalina lavando o poço com 200 μl de água estéril. Repita a lavagem mais duas vezes.
8. Adicione 100 μl de ácido acético a 33% em cada poço e incube por 15 minutos com sacudidas suaves; Isso dissolve o corante.
9. Quantifique a quantidade de biofilme formada medindo a absorção do violeta cristalino em 600 nm. A quantidade de violeta cristalina é proporcional à quantidade de biofilme formado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Triptona	BD	211705
Extrato de Levedura	BD	212750
Placa de 96 poços	Coautor de Elenco	3596
Violeta Cristalina	Sigma-Aldrich	C6158
Ácido acético	Exame de Laboratório	PLA00654X	Aviso: Inflamável
Leitor de Microplacas Synergy HT	BioTek