1. Microscopia de varredura a laser confocal do Biofilme S1 de A. baumannii
1. Cultive uma cultura de 5 ml de A. baumannii S1 em LB a 30 °C em uma incubadora agitada (220 rpm) por 16 horas.
2. Ajustar a cultura de A. baumannii S1 para um ODdesejado de 600 de 0,8. Usando um recipiente μ-Dish com fundo de vidro de 35 mm, inocule a cultura bacteriana (diluição 1:100) em LB fresco contendo 30 μl de enzima GKL purificada (40 mg/ml); O volume final da nova cultura tem 1 ml.
3. Cubra o μ-Pote com uma tampa e coloque-o em um recipiente plástico lacrado de 10 L. Incube o μ-Dish a 30 °C por 3 horas antes de remover suavemente o substrato. Adicione 30 μl de enzima GKL purificada e meio fresco, totalizando 1 ml. Incube por mais 21 horas a 30 °C.
4. Repita o passo 1.3 e incube o prato μ por mais 24 horas a 30 °C. Depois, remova a mídia com cuidado.
5. Adicionar 500 μl de aglutinina de germe de trigo conjugada Alex Fluo 488 (WGA) de 5 μg/ml dissolvida na solução salina balanceada de Hank (HBSS) ao μDish e incubar a 37 °C por 30 min; Isso vai corar o biofilme formado. Remova a solução manchante e lave o μ-Dish com 2 ml de HBSS. Repita a etapa de lavagem mais uma vez.
6. Adicione 500 μl de formaldeído dissolvido a 3,7% em HBSS e incube a 37 °C por 30 minutos; isso vai fixar o biofilme no μ-Dish. Lave o prato μ uma vez com 2 ml de HBSS e depois remova completamente a solução. O μ-Dish fixado com biofilme pode ser armazenado no escuro a 4 °C antes da imagem do CLSM.
7. Para imagens e análises CLSM, use ampliação de 63 vezes para gerar 97 pilhas por imagem, com um intervalo de 0,21 μm por pilha.
