Detecção de sacaribactérias em cultura binária usando reação em cadeia da polimerase

Resumo

Fonte: Collins, A. J., et al., Estabelecendo Culturas Binárias Estáveis de Saccharibacterias Simbióticas a partir da Cavidade Oral. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o uso da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detectar Saccharibacterias em uma cultura binária com Actinomyces. O protocolo descreve amplificação do DNA e eletroforese em gel para confirmar uma interação estável hospedeiro-parasita.

Protocolo

1. Confirme a infecção por sacaribactérias por PCR
   1. Após 5 passagens, confirme a infecção com a reação em cadeia da polimerase (PCR). Cinco passagens garantirão que quaisquer células de Saccharibacteria não em crescimento tenham sido esgotadas além do limite de detecção usando 25 ciclos de PCR.
   2. Prepare uma mistura master por PCR. Uma receita sugerida é a seguinte: para cada tubo necessário, prepare 12,5 μL de 2x tampão PCR, 0,75 μL 10 μM Primer frontal (580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 μM Primer reverso (1177R¹³- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM_{MgCl 2, e 9} μL de água. Misture por vortex.
   3. Aliquota 24 μL de mistura master em um tubo PCR de 0,2 mL. Adicione 1 μL de cultura infectada por sacaribactérias à reação PCR. Coloque o tubo em um termociclador e execute o seguinte protocolo: desnaturação inicial a 95 °C por 5 minutos, 25 ciclos a 95 °C por 30 segundos, 60 °C por 30 segundos, 72 °C por 30 segundos, elongação final a 72 °C por 2 minutos, depois fixação final a 4 °C.
   4. Carregue e execute os produtos de PCR em um gel de agarose a 1%. Uma faixa de ~600 bases indicará a presença de Saccharibacteria.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	Fisher Scientific	BP160-100
Caldo de infusão Brain Heart (pó desidratado)	Becton-Dickinson	211059	Ou outro meio de crescimento adequado para organismos-alvo
Fonte de Alimentação por Eletroforese	Bio-Rad	1645052
Equipamento de Eletroforese	Bio-Rad	1704467
GoTaq Green Mastermix	Promega	M7122
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf	950040025	Ou termociclador equivalente para PCR
Solução de MgCl₂ 25mM	Promega	A3513
Água de grau em Biologia Molecular	Fisher Scientific	BP2819100
Micropipeta P-1000	Gilson	F123601G
Tubos PCR 0,2 mL	Fisher Scientific	14-230-205
Pontas de pipeta - 1000 μL	Fisher Scientific	02-717-166
Coloração segura para gel de DNA SYBR	ThermoFisher Scientific	S33102
Caldo de Soja Triptico (pó desidratado)	Becton-Dickinson	211825	Ou outro meio de crescimento adequado para organismos-alvo