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NOTA: Durante todo o experimento, células de macrófagos são incubadas a 37 °C em uma incubadora de ar forçado com 5% deCO2 e retiradas da incubadora apenas para manipulações experimentais, realizadas em um gabinete de segurança biológica Classe II. Trabalhar com a bactéria Listeria monocytogenes está de acordo com as regulamentações de segurança biológica nível 2.
1. Preparação Celular e Infecção Bacteriana (Dias 1 e 2)
- Dia 1
- Seme 2,0 x 107 células de macrófagos derivadas da medula óssea (BMDM) em um prato de 145 mm em meio de 30 ml BMDM + Pen-Strep (Tabela 2). Seme 3 placas para cada cepa bacteriana a ser analisada. Incubar durante a noite a 37 °C em uma incubadora de ar forçado com 5% de CO2 .
- Inicie uma cultura bacteriana durante a noite da cepa selvagem (WT) L. monocytogenes 10403S em 10 ml de meio de infusão cerebral cardíaca (BHI), a 30 °C em uma incubadora padrão. Coloque tubos de cultura inclinados sem tremer.
NOTA: Essas condições de crescimento regulam a expressão dos genes dos flagelos, o que promove uma infecção eficiente.
- Dia 2
- Meio BMDM pré-quente (sem antibióticos Pen-Strep) (Tabela 2) e soro tampão fosfatado (PBS) a 37 °C.
- Lave a monocamada de macrófagos duas vezes com 25 ml de PBS pré-aquecido para remover os antibióticos. Adicione 30 ml de medium BMDM fresco.
- Lave 1,5 ml de cultura bacteriana durante a noite com PBS centrifugando as bactérias a > 14.000 x g por 1 minuto, descartando o sobrenadante e ressuspendendo as bactérias suavemente em 1,5 ml de PBS por pipeteamento. Repita duas vezes.
- Infecte cada placa de macrófagos com 0,5 ml de uma cultura lavada durante a noite de L. monocytogenes do tipo selvagem. Se usar várias placas, infecte cada placa com 15 minutos de intervalo. Esse intervalo permitirá a colheita de cada placa individualmente ao final da infecção.
NOTA: A multiplicidade de infecção (MOI) é avaliada por meio de placas de diluições seriadas de cultura bacteriana usadas para infecção em placas de ágar BHI e contagem de unidades formadoras de colônias (CFU) após incubação de placas de 24 horas a 37 °C. O uso de 0,5 ml de WT L. monocytogenes cepa 10403S resulta em um MOI de ~ 100 (100 UFC bacterianas por célula macrófaga). Ao analisar mutantes bacterianos com defeito no crescimento intracelular, deve-se considerar um MOI mais alto. - Após uma incubação de 0,5 horas a 37 °C, lave as células infectadas duas vezes com PBS para remover bactérias não aderidas, e adicione 30 ml de meio BMDM pré-aquecido. As bactérias anexadas vão internalizar durante as próximas 0,5 horas.
- Em 1 hora após a infecção, adicione 30 μl de gentamicina (1:1.000 para atingir uma concentração final de 50 μg/ml) para matar bactérias extracelulares.
- Montar o aparelho de filtro colocando uma cabeça de filtro em um frasco de líquido coletor com uma saída a vácuo. Depois, coloque um filtro (0,45 μm) em uma cabeça de filtro, seguido por um funil cilíndrico, e fixe as diferentes partes com uma gramposa metálica. Prepare água gelada e sem RNase.
- Às 6 horas após a infecção, colhe bactérias das células infectadas da seguinte forma. Trate cada prato individualmente.
NOTA: Normalmente, L. monocytogenes completa 1-log de crescimento durante 6 horas de infecção nas células de macrófagos. Incubações mais longas podem resultar em crescimento excessivo bacteriano e morte celular dos macrófagos, enquanto períodos de incubação mais curtos podem resultar em cargas bacterianas consideravelmente menores. O MOI e o momento da infecção podem ser modificados para atingir condições ideais.- Lave as células infectadas com PBS uma vez. Adicione 20 ml de água fria e sem RNase para lisar células de macrófagos. Usando um raspador de células, raspe as células da placa rapidamente, mas com cuidado.
- Colete células lisadas em um tubo cônico de 50 ml. Vórtice por 30 segundos. Centrifuge a 800 x g por 3 minutos a 4 °C.
- Passe o sobrenadante pelo aparelho de filtragem usando um sistema de vácuo. Usando uma pinça, role o filtro e transfira rapidamente para um tubo cônico de 15 ml. Congele rapidamente os tubos com os filtros em nitrogênio líquido.
- Montar o aparelho de filtragem com um novo filtro para a próxima amostra, conforme descrito na 1.2.7.
- Armazene os filtros congelados a -80 °C para o dia seguinte. Alternativamente, prossiga diretamente para a extração de ácidos nucleicos.
Tabela 1: Protocolo de Reação DNase.
| RNA | até 2 μg (no volume máximo de 44 μl) |
| Buffer DNase 10x | 5 μl |
| Água livre de RNase | completo até 50 μl volume total |
| DNAse | 1 μl (1 unidade) |
Tabela 2: Receitas de Mídia e Buffers.
| 1. 500 ml de meio BMDM+Pen-Strep (Filtrado esterilizado): | |
| Eagle Médio Modificado (DMEM) de Dulbecco | 235 ml |
| Soro fetal bovino (FBS) (inativado 30 min a 54 °C) | 100 ml |
| Fator estimulante de colônias de macrófagos ou M-CSF (meio condicionado L-929) | 150 ml |
| Glutamina | 5 ml |
| Piruvato de sódio | 5 ml |
| β-Mercaptoetanol | 0,5 ml |
| Penicilina/Estreptomicina | 5 ml |
| Total | 500 ml |
| 2. 500 ml BMDM (Esterilizado com filtro): | |
| DMEM | 235 ml |
| FBS (inativado 30 min a 54 °C) | 100 ml |
| M-CSF (L-929 médio condicionado) | 150 ml |
| Glutamina | 5 ml |
| Piruvato de sódio | 5 ml |
| β-Mercaptoetanol | 0,5 ml |
| Total | 500 ml |
| 3. Buffer AE | |
| Acetato de sódio (NaOAc) pH 5,2 | 50 mM |
| Ácido etilenediaminotetraacético (EDTA) | 10 mM |
| Água livre de RNase | |
| 4. fenol-clorofórmio-IAA | |
| Fenol | 25 ml |
| Clorofórmio | 24 ml |
| Álcool iso-amílico | 1 ml |
| 5. clorofórmio-IAA | |
| Clorofórmio | 24 ml |
| Álcool iso-amílico | 1 ml |