Extração de RNA de Listeria monocytogenes colhida de Macrófagos Murinos Infectados

Resumo

Fonte: Sigal, N., et al. Purificação de RNA a partir de Listeria monocytogenes Cultivada Intracelularmente em Células Macrófagos. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a extração de RNA de Listeria monocytogenes isolada de macrófagos murinos infectados. O protocolo preserva o RNA, lisa células usando fenol–clorofórmio e calor, e separa o RNA por centrifugação. Sal e etanol, combinados com incubação a frio, promovem a precipitação de RNA. O RNA resultante captura a expressão gênica induzida pelo hospedeiro, revelando a virulência bacteriana e as estratégias de adaptação.

Protocolo

1. Extração de Ácidos Nucleicos

NOTA: Realize todas as manipulações com soluções de fenol e clorofórmio em uma exaustão exaustiva.

1. Prepare uma mistura 1:1 de fenol acidificado: clorofórmio, 400 μl para cada amostra. Misture em tubos separados e retire a camada aquosa resultante por aspiração. Adicione 40 μl de SDS a 10%.
2. Descongele os tubos que contêm o filtro no gelo para mantê-los frios. A cada tubo contendo filtro, adicione 650 μl de tampão acetato-EDTA (AE) (50 mM NaOAc pH 5,2, 10 mM EDTA, água livre de RNase).
3. Execute os passos a seguir o mais rápido possível.
   1. Faça vórtice vigorosamente no tubo que contém o filtro para que ele bata para a periferia do tubo e o buffer lave completamente o filtro. Sempre mantenha o tubo frio, colocando-o de volta no gelo.
      NOTA: Pode ser necessário ainda fazer vórtice no tubo enquanto está invertido para lavar completamente as bactérias do filtro.
   2. Repita para todos os tubos. Pode ser útil reduzir a suspensão rapidamente (1 min a 120 x g) ao final do processo.
4. Transfira o tampão contendo bactérias para um tubo microcentrífuga de 1,5 ml contendo a mistura SDS e fenol/clorofórmio. Repita para todos os tubos. Pode ser necessário girar novamente os tubos contendo o filtro (1 min a 120 x g) para obter o buffer residual do filtro.
5. Coloque todos os tubos de 1,5 ml em um dispositivo de vórtice com múltiplos tubos e use o vórtice em velocidade máxima por 10 minutos.
6. Incube os tubos em um bloco de calor a 65 °C por 10 minutos. Centrifuge à velocidade máxima (> 14.000 x g) por 5 minutos.
7. Transfira a camada aquosa (cerca de 400 μl) de cada tubo para um novo tubo de 1,5 ml contendo 40 μl de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e 1,0 ml de 100% etanol. Faça vórtice de cada tubo cuidadosamente.
   NOTA: O glicogênio pode ser adicionado nessa etapa para melhorar a visualização do pellet precipitado.
8. Incube as amostras a -80 °C por 1 hora. Alternativamente, incube amostras a -20 °C durante a noite. Depois, centrifuge as amostras a 4 °C por 20 minutos à velocidade máxima (> 14.000 x g).
9. Aspire cuidadosamente o etanol (camada superior) de cada tubo. Adicione 500 μl de etanol frio a 70% em cada amostra e faça um vórtice cuidadoso. Centrifugar a 4 °C por 20 minutos à velocidade máxima (> 14.000 x g).
10. Aspire cuidadosamente o etanol de cada tubo. Seque as amostras por aproximadamente 2 minutos usando um evaporador a vácuo sem calor. Não seque demais as amostras.
11. Adicione 25 μl de água sem RNase a cada amostra. Incube em temperatura ambiente por 20 minutos. Cuidadosamente faça vórtice e desacelere.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Listeria monocytogenes 10403S
H2 O, livre de RNAse	Termo Científica	10977-015	Água tratada com DEPC pode ser usada
pH saturado de fenóis 4,3	Fisher	BP1751I-400
Clorofórmio	Fisher	BP1145-1
Álcool iso-amílico	Sigma-Aldrich	W205702
Acetato de sódio	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
SDS 10%	Sigma-Aldrich	L4522
Absoluto do etanol	Merck Millipore	1070174000
Filtros MF-Millipore 45 mm, 0,45 μm	Merck Millipore	HAWP04700
Vortex-Genie 2	Indústrias Científicas	Modelo G560E
Bloco de calor de 65 °C	Termo Científica
Centrífuga de mesa de 4 °C	Eppendorf	5417R
Pipetas estéreis, 25 ml	Greiner
Tubos Falcon, 50 ml	Greiner
Tubos de 1,7 ml, sem RNase	Axygen	MCT-175-C
Sistema SpeedVac	Termo Científica	SPD131DDA