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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.
1. Preparação de Inoculo Bacteriano Uropatogênico de Escherichia coli (UPEC)
- Prepare infecções urinárias 89 (UTI89) (início 72 horas antes do dia da inoculação)
- Alinee o UTI89 em uma placa de ágar LB (Luria-Bertani) a partir de um estoque congelado. Incube durante a noite a 37 °C. Escolha uma colônia e inocule em 10 ml de LB em um frasco de 125 ml. Incubar a 37 °C por 24 horas, de forma estática.
- Inocule 10 μl de cultura durante a noite em 10 ml de LB em um novo frasco de 125 ml por mais 24 horas a 37 °C, estaticamente.
- Transfira 3 ml (varia conforme a cepa e o tamanho do inoculo desejado) para tubos estéreis de 1,5 ml, centrifuge a 7.000 x g por 3 minutos e ressuspenda o pellet em 1x soro tampão fosfatado (PBS) e centrifuge uma segunda vez. Ressuspenda o pellet bacteriano em 1 mL de 1x PBS.
- Meça a densidade óptica bacteriana e ajuste a concentração para a densidade do inóculo desejada. A concentração padrão do inóculo utilizado é de10,7 bactérias; no entanto, isso pode variar devido ao design do estudo.
2. Inoculação bacteriana
- Limpe a estação de trabalho com etanol 70% e cubra a área com papel absorvente (ou use um exaustor de fluxo estéril).
- Extraia até 0,9 ml do inóculo bacteriano preparado em uma seringa de 1 ml de tuberculina (TB) (remova as bolhas de ar). Fixe uma agulha de inoculação estéril preparada com polietileno com designação de 10 (PE10) de tubo na seringa contendo o inóculo, e então apare estérilmente o tubo de polietileno.
NOTA: Deixe 1 mm de tubo acima da ponta da agulha para evitar perfurar a bexiga. - Corte um pedaço quadrado de parafilm de 1 polegada e passe um pouco de lubrificante cirúrgico (aproximadamente do tamanho de uma moeda de dez centavos) por cima.
- Anestesie camundongos C3H/HeN fêmeas colocando-os em uma câmara de vaporizador (seguindo o protocolo do fabricante) até ficarem inconscientes, mas ainda respirando normalmente (1 respiração/segundo).
ATENÇÃO: Isoflurano é um anestésico inalado. Use em um local bem ventilado e minimize a inalação. - Retire o rato do vaporizador, coloque-o de costas em um papel toalha e abra as pernas.
- Cubra o nariz do camundongo com um cone nasal (um tubo conectado ao vaporizador que fornece uma dose controlada de isoflurano que vem em algumas unidades vaporizadoras) para manter a anestesiação.
- Palpe suavemente a bexiga para induzir a micção e garantir que a bexiga esteja esvaziada. Limpe a área periuretral com um lenço 100% de etanol. Toque a agulha/seringa de inoculação, apontando primeiro, para dentro do lubrificante cirúrgico.
- Inocule cada camundongo com 50 μl da solução bacteriana inserindo a agulha de inoculação transuretralmente, aproximadamente 12 mm, e pressionando suavemente o êmbolo da seringa para dispensar o inóculo na bexiga (10 μl/s). Remova a agulha de inoculação do rato.
NOTA: O retorno imediato do inóculo na abertura da uretra ao iniciar a inoculação indica inserção inadequada ou incompleta da agulha. - Remova o rato do cone do nariz e o coloque de volta na gaiola. Repita os passos 2.3-2.8 para cada mouse. Quando/se for trocar de condição/cepas do inóculo, descarte a seringa e a agulha de inoculação em um recipiente aprovado para objetos cortantes e comece novamente no passo 2.2.
NOTA: A inoculação com organismos uropatogênicos geralmente não causa sintomas de dor severa. No entanto, em casos raros, administrar grandes doses de patógenos pode causar febre, redução na ingestão de alimentos e água, e comportamento anormal. A saúde animal deve ser monitorada durante todo o experimento. Se sintomas de dor evidentes forem notados, um analgésico, como Buprenorfina (0,05−0,1 mg/kg administrado subcutâneo), pode ser aplicado.
3. Enumeração de comunidades bacterianas intracelulares (IBC)
- Remova a bexiga assépticamente e coloque-a em 1x PBS em uma placa de 6 poços com fundo de silicone. As placas podem ser preparadas usando um kit de elastomer de silicone e despejando aproximadamente 1 cm de silicone em cada poço. Corte a bexiga ao meio usando tesoura.
- Usando pequenos pinos de metal, abra suavemente a bexiga para que o lúmen da bexiga fique voltado para cima. Certifique-se de posicionar os pinos nas bordas mais externas das seções da bexiga para garantir que a máxima quantidade possível de urotélio fique exposta.
- Depois de espalhar, lave suavemente a bexiga uma vez com 1x PBS. Remova o PBS 1x com pipeta. Corriga a bexiga adicionando paraformaldeído suficiente a 3% para cobrir toda a bexiga aberta.
ATENÇÃO: O paraformaldeído é cancerígeno. Equipamentos de proteção adequados, incluindo luvas, devem ser usados o tempo todo. O descarte deve seguir as diretrizes institucionais. - Incube em temperatura ambiente por 1 hora. Remova a solução de paraformaldeído. Lave uma vez com 1x PBS.
- Lave com solução de lavagem LacZ (2 mMMgCl 2, desoxicolato de sódio 0,01% e 0,02% nonidet-p40 em 1x PBS) três vezes por 5 minutos por lavagem.
- Remova a solução de lavagem e aplique tinta suficiente de LacZ (9,5 ml de solução de lavagem LacZ, 0,4 ml de 25 mg/ml X-gal e 0,1 ml de 100 mM de K-ferrocianeto/K-ferricianeto) para cobrir as bexigas. Incube a 30 °C durante a noite protegido da luz.
- Remova as bexigas abertas da incubadora e observe os IBCs, que aparecem como pontos azuis visualizados com um telescópio de dissecação, ampliação de 40 a 60X.
NOTA: Às vezes, um camundongo pode urinar antes da colocação do tubo sob a uretra. Nesse caso, espere de 15 a 20 minutos antes de tentar coletar urina novamente.