Estabelecendo um modelo camundongo de infecções por queimaduras com bactérias patogênicas

Resumo

Fonte: Wang, Y., et al. In Vivo Investigação da Terapia Antimicrobiana de Luz Azul para Infecções por Queimaduras por Acinetobacter baumannii multirresistente a medicamentos usando imagem por bioluminescência. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra como estabelecer uma infecção por queimadura em um modelo de camundongo aplicando um bloco de latão aquecido seguido por um inoculo bacteriano patogênico. As bactérias colonizam a matriz extracelular exposta e formam um biofilme, possibilitando estudos in vivo das interações hospedeiro-patógeno.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.

1. Modelo de camundongo de infecção por queimadura causada por Acinetobacter baumannii bioluminescente

1. Use fêmeas adultas de camundongos BALB/c com idades entre 7 e 8 semanas e com peso de 17 a 19 g. Permita que os camundongos se aclimatem às condições de laboratório por pelo menos 3 dias antes do início do experimento. Mantenha os camundongos em um ciclo de 12 horas claro/escuro sob uma temperatura ambiente de 21 °C e dê comida e água a eles de forma espontânea.
2. Anestesie os camundongos com uma injeção intraperitoneal de um coquetel cetamina-xilazina (100 mg/kg-20 mg/kg). Toque levemente a palpebra de cada camundongo com um cotonete; a ausência do reflexo palpebral sugere uma profundidade anestésica adequada. Cubra os olhos do camundongo com pomada veterinária para evitar que ressecem durante a anestesia.
3. Raspe os ratos nas costas para expor o máximo de pele possível usando um aparador de cabelo de 50 lâminas.
4. Coloque a tampa de uma placa de Petri de 35 mm sob o abdômen de cada rato para manter suas costas relativamente horizontais.
5. Ferva água em um béquer de 250 mL (80% cheio) usando uma placa elétrica de corrente alternada (VAC) de 10" x 10", 220 volts. Imerga um bloco de latão (seção transversal de 1 cm x 1 cm) no béquer até atingir o equilíbrio térmico com a água. O equilíbrio térmico geralmente leva <5 minutos e é indicado pela refervura da água no béquer.
6. Antes de causar a queimadura, administre analgésicos preventivos (uma injeção subcutânea de 0,1 mg/kg de buprenorfina) para alívio da dor.
7. Dez minutos após os analgésicos preventivos, pressione suavemente o bloco de latão aquecido na área raspada nas costas dos camundongos por 7 segundos para induzir queimaduras.
   NOTA: Para evitar danos térmicos ao pessoal em funcionamento, use luvas resistentes ao calor ao realizar o procedimento de queima.
8. Administre 0,5 mL de soro fisiológico estéril por injeção subcutânea para evitar desidratação.
9. Cinco minutos após a indução da lesão térmica, inocule 50 μL de suspensão bacteriana contendo 5 unidades formadoras de colônias (UFC) de 10⁶ em soro salino tamponado com fosfato (PBS) nas queimaduras de camundongos usando uma pipeta. Depois, usando um cotonete estéril em movimento ziguezague na pele, espalhe as aliquotas nas queimaduras para distribuir as células bacterianas na área queimada da forma mais uniforme possível.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Rato	Laboratórios Charles River, Wilmington, MA	BALB/c	7-8 semanas de idade, 17-19 g de peso
Acinetobacter baumannii	Centro Médico do Exército Brooke, Fort Sam Houston, TX	Isolado clínico	Cepa luminescente engenheirada
Seringas de insulina	Fisher Scientific	14-826-79	Seringas de insulina BD Lo-Dose U-100 para injeção
Cloreto de sódio	Fisher Scientific	721016	0,9% cloreto de sódio
Solução fisiológica tamponada com fosfato, solução 1x	Fisher Scientific	BP24384	Um tampão padrão de fosfato usado em muitos procedimentos biomoleculares
Anilhas inoculadoras	Fisher Scientific	22-363-605	Para espalhar inoclum bacteriano na superfície de queimadura de camundongos
Bloco de latão	Small Parts, Inc., Miami, FL	10 mm por 10 mm	Para a criação de queimaduras em camundongos
Luvas Extreme Dragon PBI/Kevlar de alta temperatura	Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY	PBI83514	Luvas resistentes ao calor
Pratos Greiner	Sigma-Aldrich Co. LLC	P5112-740EA	35 mm ×10 mm
Placa elétrica digital Corning	Companhia de Instrumentos Cole-Parmer, LLC	UX-84301-65	10" x 10", 220 VAC, para água fervente
Cama cirúrgica de linha fina de rato aquecida por água	Sistemas E-Z	EZ-211	Previne a perda de calor e a hipotermia durante a cirurgia
Pomada veterinária	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	Pomada oftálmica para prevenir o ressecamento ocular