Imagem por Bioluminescência de Queimaduras Infectadas por Acinetobacter baumannii em Camundongos

Resumo

Fonte: Wang, Y., et al. In Vivo Investigação da Terapia Antimicrobiana de Luz Azul para Infecções por Queimaduras por Acinetobacter baumannii multirresistente a medicamentos usando imagem por bioluminescência. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o procedimento para imagem de infecções por queimaduras em camundongos inoculados com Acinetobacter baumannii que transportam um operon bioluminescente. Ele demonstra como a oxidação do substrato catalisada por luciferase produz luz proporcional à carga bacteriana, permitindo o monitoramento em tempo real da progressão da infecção usando um sistema de imagem por bioluminescência.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.

1. Imagem por Bioluminescência de Infecções em Camundongos

1. Fotografe os camundongos usando um sistema de imagem de baixa luminosidade que inclui uma câmera de dispositivo acoplado com carga intensificada, um controlador de câmera, uma câmara de amostra e um processador de imagem.
2. Anestesie os camundongos com uma injeção intraperitoneal de um coquetel cetamina-xilazina (100 mg/kg - 20 mg/kg). Toque levemente o palpebral dos camundongos com um cotonete; a ausência do reflexo palpebral sugere uma profundidade anestésica adequada.
3. Inicie o software de imagem ao vivo. No painel de controle que aparece, clique em Inicializar. Espere até que a cor da caixa de temperatura fique verde, indicando que a temperatura do estágio na câmara da amostra atingiu 37 °C.
4. Coloque os camundongos no palco (37 °C) na câmara de amostras do sistema de imagem, com as queimaduras infectadas diretamente sob a câmera.
   NOTA: A bioluminescência das bactérias pode diminuir quando as queimaduras secam. Portanto, recomenda-se hidratar as queimaduras do camundongo com PBS antes da imagem.
5. No painel de controle, marque um seletor ao lado de "Luminescência." Selecione "Exposição automática" para que o tempo de exposição para imagem seja otimizado pelo software de imagem ao vivo com base na intensidade da bioluminescência.
6. Selecione "C" na lista suspensa "Campo de Visão". Selecione a opção "Escanear médios" para deixar o software determinar a distância focal. Coloque um seletor ao lado de Overlay.
7. Clique em "Adquirir" para capturar a imagem. Na caixa "Editar Etiqueta de Imagem", clique em "OK"; uma "Janela de Imagem" e "Paleta de Pedo" aparecerão.
8. Defina parâmetros de ROI automático para seleção automática.
9. Quantifique a intensidade da bioluminescência como unidades relativas de luminescência (RLUs) e exiba a bioluminescência em uma escala de cor falsa, variando do rosa (mais intenso) ao azul (menor intensidade).
10. Calcule a fração de sobrevivência das bactérias em queimaduras de camundongos em diferentes momentos de tempo com base na análise de intensidade da bioluminescência. A fração de sobrevivência das bactérias em um determinado momento = a intensidade da bioluminescência medida nesse momento / a intensidade da bioluminescência medida logo antes da exposição à luz azul antimicrobiana.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
IVIS	PerkinElmer Inc, Waltham, MA	IVIS Lumina Série III	Imagem pré-clínica in vivo
LED de diodo emissor de luz	VieLight Inc, Toronto, Canadá	415 nm	Fonte de luz para iluminação
Rato	Laboratórios Charles River, Wilmington, MA	BALB/c	7-8 semanas de idade, 17-19 g de peso
Acinetobacter baumannii	Centro Médico do Exército Brooke, Fort Sam Houston, TX	Isolado clínico	Cepa luminescente engenheirada
Pratos Greiner	Sigma-Aldrich Co. LLC	P5112-740EA	35 mm ×10 mm