Entrega mediada por agrobactérias de clones virais recombinantes em mudas de milho para silenciamento gênico

Resumo

Fonte: Beernink, B. M. et al. Agroinoculação direta de mudas de milho por injeção com clones infecciosos do Vírus do Mosaico do Rabo-de-Raposa Recombinante e do Vírus do Mosaico da Cana-de-Açúcar. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a entrega mediada por Agrobacterium de clones virais recombinantes em mudas de milho para silenciamento gênico. Ele descreve o processo de infecção por Agrobacterium , disseminação viral sistêmica e mudanças fenotípicas impulsionadas pela interferência de RNA.

Protocolo

1. Injeção
NOTA: Mudas de milho de 4 a 7 dias de idade podem ser usadas para injeção. A taxa de crescimento das mudas é fortemente afetada pelas condições de crescimento, pela quantidade de radiação fotossinteticamente ativa (PAR) (ou seja, maior PAR na estufa do que na câmara de crescimento) e pelo genótipo, entre outras coisas que podem ser difíceis de controlar em condições de estufa. As plantas podem ser injetadas a partir de 4 dias de idade, quando medem 2-3 cm de altura sem folhas expandidas, e até 7 dias quando a folha mais baixa e arredondada está expandida. A taxa de sucesso desse método de inoculação cai rapidamente à medida que as plantas envelhecem além de 7 dias após a semeadura. O local de injeção é o mesmo independentemente da idade das mudas.

1. Usando óculos de proteção, injete a suspensão bacteriana nas mudas 2-3 mm acima do nó coleoptilar usando uma agulha de 25G x 5/8" presa a uma seringa descartável de 1 mL.
   NOTA: O nó coleoptilar é onde as raízes da coroa eventualmente se formam. Este é o nó mais baixo da planta. Normalmente, haverá uma mudança de cor de verde para branco no nó e abaixo dele. O local da injeção fica logo acima do meristem. Dissecar algumas mudas nessa fase pode ajudar a visualizar a localização do meristemo e, consequentemente, o local correto de injeção.
2. Aplique uma pressão suave na seringa até que a suspensão preencha o coleoptil ou fique visível no verticilo, dependendo da fase de crescimento das plantas. Isso corresponde a aproximadamente 100-200 μL de suspensão.
   NOTA: Se for difícil injetar a suspensão na muda, o local de injeção pode estar muito baixo. Pressão moderada é tudo o que deve ser necessário para injetar a suspensão.
3. Injete todas as mudas, trocando seringas e agulhas para cada construção.

2. Cuidado contínuo com plantas

1. Transplante as mudas injetadas para vasos de 13 x 13 x 15 cm ou maiores quando estiverem com 7-8 dias de vida.
2. Mantenha as condições de crescimento (fotoperíodo de 16 horas e fertilização uma vez por semana).

3. Confirmação da infecção (fenotípicamente)

1. O escore fenotípico é das plantas entre 14 e 21 dias após a inoculação (DPI). Lesões causadas pelo silenciamento dos genes controle da lesão mimítica 22 ou fitoeno desaturase podem ser facilmente observadas nas folhas e são distintas dos sintomas da FoMV.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringas de 1 mL	Fisher Scientific	14955450	alternativamente, BD 309659
Cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101			Carrega plasmídeo de vir que codifica máquinas de transferência de T-DNA, RifR, GmR, provenientes de material laboratorial
Fertilizante			Concentrado de Fertilizante Peters 15-15-15
Vasos Grandes	Kordlok	SQL0550	5x5x4" ou maior. Para transplantar mudas.
Semente de Milho Doce Golden Bantam	Prados Americanos, Sementes da Costa Oeste
Substrato do Solo	Horticultura SunGro	SS#1-F1P	Mistura Sunshine #1/Fafard-1P, qualquer mistura de solo onde o milho cresce bem é suficiente