Estabelecimento de biofilmes entre reinos bacterianos-fúngicos para estudo da patogênese oral

Resumo

Fonte: Schlafer, S, e Frost Kristensen, M. Monitorando o pH Extracelular em Biofilmes Cruzados do Reino usando Microscopia Confocal. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o cultivo de biofilmes cruzados entre Streptococcus mutans e Candida albicans sob condições semelhantes às orais para modelar interações bactéria-fúngico, possibilitando o estudo da sinergia microbiana, adesão mediada pelo glucano e virulência acidogênica na patogênese oral.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Cultivo de Biofilmes Inter-Reinos

1. Cultive Streptococcus mutans (S. mutans) DSM 20523 e Candida albicans (C. albicans) NCPF 3179 em placas de ágar sanguíneas a 37 °C sob condições aeróbicas.
2. Transfira colônias individuais de cada organismo para tubos de ensaio preenchidos com 5 mL de infusão cerebral cardíaca (BHI). Cultive por 18 horas em condições aeróbicas a 37 °C.
3. Centrifuge as culturas durante a noite a 1.200 x g por 5 minutos. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em soro fisiológico e ajuste o OD_{550 nm} para 0,5 para C. albicans (~10⁷ células/mL) e S. mutans (~10⁸ células/mL). Dilua a suspensão de S. mutans 1:10 com soro fisiológico estéril (~10⁷ células/mL).
4. Pipete 50 μL de solução salivar estéril, para os poços de uma placa óptica inferior de 96 poços para microscopia. Incube por 30 minutos a 37 °C. Lave os poços 3 vezes com 100 μL de soro fisiológico estéril. Esvaziem os poços.
5. Adicione 100 μL de suspensão de C. albicans em cada poço. Incube a 37 °C por 90 minutos. Lave 3 vezes com soro fisiológico estéril.
   NOTA: Não esvazie completamente os poços durante a lavagem. Deixe um reservatório de 20 μL para evitar forças de cisalhamento excessivas.
6. Adicione 100 μL de soro fetal bovino inativado por calor (inativado a 56 °C por 30 minutos) em cada poço. Incube a 37 °C por 2 horas. Lave 3 vezes com soro fisiológico estéril. Esvazie os poços, deixando um reservatório de 20 μL.
7. Adicione 100 μL de suspensão S. mutans (preparado no passo 1.3) a cada poço. Adicione 150 μL de BHI contendo 5% de sacarose. Incube a 37 °C por 24 horas ou mais. Ao cultivar biofilmes mais antigos, mude o meio diariamente para um BHI fresco. Ao final da fase de crescimento do biofilme cruzado, lave 5 vezes com soro fisiológico estéril.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de ágar com sangue	Instituto de Soro Statens	677
Infusão cerebral e cardíaca	Oxoide	CM1135
Infusão cerebral e cardíaca + 5% de sacarose	Suprimentos laboratoriais do BDH	10274
Candida albicans	Coleção Nacional de Fungos Patógenos	NCPF 3179
Soro fetal bovino	Tecnologias Gibco Life	10270
Centrífuga refrigerada GS-6R	Beckman	N/A
μ-Plate 96 Poço Preto	Ibidi	89626
Solução fisiológica estéril	VWR	6404
Streptococcus mutans	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen	DSM 20523
Vis-espectrofotômetro V-3000PC	VWR	N/A