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1. Preparação de pastilhas de silício
- Projete as geometrias do canal microfluídico em software de design assistido por computador (CAD; veja Tabela de Materiais) e imprima em um filme transparente para criar a fotomáscara (Figura 1A).
- Fabrique o molde mestre por litografia suave (em condições de sala limpa) seguindo os passos abaixo.
- Asse a pastilha de silício a 200 °C por 2 horas.
- Coloque a pastilha no centro de um spin-coater e despeje fotorresiste SU8 3050 (veja Tabela de Materiais) sobre a pastilha. Spinpe coat a 1.700 rpm por 40 segundos com um tempo de rampa de 10 s/100 rpm.
NOTA: Os parâmetros do revestimento de spin foram definidos para obter uma espessura-alvo de 100 μm para o SU8 3050. - Após o processo de spin-coating, coze suavemente a pastilha de silício a 65 °C por 600 s e 95 °C por 2.700 s. Deixe a pastilha esfriar em temperatura ambiente durante a noite.
NOTA: O resfriamento durante a noite melhora a adesão do SU8 à pastilha. - Coloque a fotomáscara (passo 1.1) sobre a pastilha e exponha-a à luz UV, com uma energia de exposição de 250 mJ/cm² e um comprimento de onda de 350 nm.
- Após a exposição, asse o substrato exposto a 65 °C por 60 s e 95 °C por 300 s.
- Revele a pastilha de silício para obter o molde mestre, mergulhando-a em um béquer preenchido com revelador mrDev600 (veja Tabela de Materiais). Agite suavemente o béquer por 1.800 segundos para lavar a resistência não polimerizada. Depois, faça uma lavagem spray de isopropanol na pastilha de silicone e sece ao ar.
- Assa duramente a pastilha de silício a 200 °C por 1.800 s.
- Silanize o molde mestre por meio da deposição de vapor de 20 μL de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano (ver Tabela de Materiais) colocado em uma lâmina de vidro ao lado do molde por 40 minutos em um dessecador a vácuo, criando uma pressão calibre de 100 mbar.
2. Fabricação do dispositivo microfluídico
NOTA: O procedimento de fabricação descrito aqui é para um dispositivo microfluídico com um canal microfluídico. No entanto, o mesmo método pode ser aplicado para fabricar um dispositivo microfluídico com múltiplos canais microfluídicos em paralelo.
- Misture o elastomero com seu reticulador na proporção de 10:1 (veja Tabela de Materiais) para preparar uma mistura de polidimetilsiloxano (PDMS). Mexa a mistura até que fique uniformemente misturada e fique opaca devido às bolhas de ar fechadas.
- Desgasifica a mistura em um dessecador a vácuo, criando uma pressão de calibre de 100 mbar até que as bolhas de ar presas sejam removidas e ela pareça transparente. O tempo necessário para a desgaseificação é tipicamente de 30 minutos.
- Coloque o molde mestre (passo 1) em um prato de cultura celular (veja a Tabela de Materiais). Despeje 20 g da mistura PDMS no molde mestre para produzir canais com espessura final de 5 mm.
- Asse o molde mestre a 70 °C por 2 horas.
- Corte o PDMS curado ao redor do canal microfluídico (a uma distância de aproximadamente 3 mm) usando uma lâmina e depois retire o canal microfluídico do molde mestre.
- Para criar a entrada e saída dos canais microfluídicos, perfure os furos com um punção de biópsia (diâmetro de 1,5 mm) em suas extremidades (topo dos triângulos, veja Figura 1A). Faça um furo adicional no centro do triângulo de entrada para instalar o sensor de pressão depois.
- Lave uma lâmina de vidro e o canal microfluídico com uma solução de detergente comercial de 1% (veja a Tabela de Materiais) por 5 minutos, depois enxágue com água desionizada. Em seguida, lave o canal microfluídico do PDMS e a lâmina de vidro com isopropanol. Depois, enxágue novamente com água desionizada. Seque o canal microfluídico do PDMS e a lâmina de vidro com ar comprimido a 1 bar por 1 minuto.
NOTA: A estrutura porosa do PDMS deve estar completamente seca para que a ligação seja eficaz. - Coloque a lâmina de vidro e o canal microfluídico em um limpador de plasma (veja a Tabela de Materiais) e certifique-se de que as superfícies a serem coladas estejam voltadas para cima. Ligue o limpador de plasma e trate o canal microfluídico e a lâmina de vidro com plasma de ar a um fluxo de ar de 1 SL/h (litro padrão por hora) por 1 minuto. Ligue o canal microfluídico ao lâmina de vidro imediatamente após tirá-los do limpador, colocando-os em contato um com o outro.
NOTA: Certifique-se de não tocar nas superfícies tratadas, pois isso pode afetar a aderência. Ao fabricar um dispositivo microfluídico com múltiplos canais microfluídicos, exponha os canais microfluídicos simultaneamente e ligue-os em uma única etapa. - Coloque o dispositivo microfluídico ligado em uma placa elétrica de 80 °C por pelo menos 15 minutos.
- Armazene o dispositivo microfluídico em um prato de cultivo celular limpo até o início do experimento.
3. Preparação da suspensão bacteriana
- Cultive uma população de Bacillus subtilis NCIB 3610 por 20 horas antes do início do experimento, inoculando diretamente 3 mL de meio de cultura do caldo nutritivo nº 3 (veja Tabela de Materiais) a partir de um estoque de glicerol congelado em um tubo de cultura de 15 mL. Incube em uma incubadora agitada a 30 °C e 200 rpm durante a noite (por 16 horas).
- Faça uma subcultura a partir da cultura durante a noite 4 horas antes do início do experimento, adicionando 3 μL da cultura durante a noite em 3 mL de meio fresco (diluição 1:1.000) em um tubo de cultura de 15 mL. Incube a subcultura em uma incubadora agitada a 30 °C a 200 rpm por 3,5-4 horas para obter uma densidade óptica de 600 nm (OD₆₀₀) de 0,1.
4. Experimento de crescimento de biofilme
- Ligue a incubadora de caixa do microscópio 3 horas antes do experimento para garantir uma temperatura estável de 25 °C. Monte a bomba da seringa e os sensores de pressão (veja a Tabela de Materiais).
- Conecte os tubos de entrada e saída ao dispositivo microfluídico. Insira diretamente uma agulha (com diâmetro externo de 0,6 mm) no tubo de entrada para garantir a conexão entre o tubo e a seringa.
- Coloque o dispositivo microfluídico, 30 mL de água desionizada e 30 mL de meio de cultura em um dessecador a vácuo e desgaseine-os por pelo menos 1 hora. Depois, puxe lentamente o meio de cultura e a água deionizada para duas seringas separadas de 30 mL.
NOTA: Essa etapa é crucial para evitar a formação de bolhas no canal durante a lavagem com o meio de cultura. - Monte o dispositivo microfluídico no microscópio e coloque o tubo de saída em um recipiente de resíduos.
- Conecte a seringa cheia de água desionizada ao canal microfluídico através do tubo microfluídico e injete lentamente a água até que ela saia pela saída do sensor de pressão. Encha o sensor de pressão com água e lave todas as bolhas do tubo que conecta o canal microfluídico ao sensor de pressão. Feche a saída do sensor de pressão com os parafusos dedicados ao sensor de pressão.
NOTA: O procedimento de enchimento descrito garante que as variações de pressão na entrada dos canais microfluídicos serão registradas com precisão. Ao realizar um experimento com múltiplos canais microfluídicos, conecte cada canal a uma seringa separada para garantir condições iguais de fluxo em todos os canais.
- Preencha o restante do canal microfluídico com a água desionizada.
- Coloque um filtro de 1,2 μm (veja a Tabela de Materiais) na seringa do meio de cultura. Depois, remova a seringa de água e conecte cuidadosamente a seringa de meio de cultura ao tubo microfluídico de entrada. Monte a seringa na bomba e lave o canal com o meio de cultura a uma vazão de 2 mL/h por 1 hora.
NOTA: O filtro impede que células bacterianas entrem na seringa durante o carregamento. Lavar o canal microfluídico com o meio de cultura removerá as bolhas restantes na estrutura porosa. - Ajuste a bomba de seringa na vazão desejada (aqui 1 mL/h) durante o experimento e ajuste a leitura de pressão dos sensores de pressão para zero.
NOTA: Ao definir a leitura inicial de pressão para zero, apenas a diferença de pressão causada pelo desenvolvimento do biofilme durante o experimento será medida. - Pipete 1 mL da cultura bacteriana a um OD₆₀₀ de 0,1 em um frasco de centrífuga de 1,5 mL. Carregue a cultura bacteriana no canal microfluídico colocando o tubo de saída no frasco da centrífuga. Após esperar 5 minutos para remover quaisquer bolhas de ar potenciais da saída dos tubos, retire-se 150 μL de solução bacteriana com uma vazão de 1 mL/h, até que o canal microfluídico esteja preenchido com a cultura bacteriana.
- Remova cuidadosamente o filtro de seringa do meio de cultura e coloque a saída dentro do recipiente de resíduos. Deixe as células bacterianas em condições de fluxo zero no canal microfluídico por 3 horas para permitir sua fixação superficial no meio poroso.
NOTA: Deixar as células bacterianas em condições de fluxo zero por 3 horas foi otimizado para a fixação da cepa bacteriana utilizada, garantindo uma cultura bem oxigenada. Outras cepas bacterianas podem exigir mais ou menos tempo. - Para iniciar o experimento, inicie o fluxo ajustando a bomba da seringa para a vazão desejada (aqui 1 mL/h) e inicie a leitura de pressão em 1 Hz.
- Adquira imagens do biofilme em crescimento no intervalo de tempo desejado, configuração óptica e ampliação.
NOTA: No presente estudo, imagens com ampliação 4x no modo campo claro em 18 posições que abrangem todo o domínio do meio poroso foram adquiridas a cada 6 minutos durante 24 horas.
