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1. Inoculação das bactérias
- Determine o número de bactérias a serem inoculadas com referência à medição a ser usada para determinar a adesão bacteriana e o tempo de incubação.
- Para estudos microscópicos envolvendo tempos de incubação inferiores a 1 dia, inocule um número relativamente grande de bactérias. Adicione uma quantidade de cultura para atingir uma concentração bacteriana final superior a10,6 bactérias por mL. Para tempos de incubação mais longos, diminua o tamanho do inoculo bacteriano.
- Para estudos em que a adesão bacteriana será medida por contagens celulares viáveis, adicione uma quantidade de cultura para atingir uma concentração bacteriana final de 103 a 106 bactérias por mL.
- Evite adicionar tantas bactérias que o metabolismo delas altere o pH ou a concentração de oxigênio no meio de incubação. Meça o pH usando papel de pH ou um eletrodo. Meça a concentração de oxigênio usando um eletrodo de oxigênio.
- Para plantas cultivadas em areia, inocule de três maneiras possíveis.
- Inocule a semente com as bactérias antes de plantar, deixando as sementes de molho por 1 minuto em uma suspensão em água com cerca de 10,6 bactérias por mL.
- Inocule a raiz germinando mudas axénicas. Quando a raiz da muda tiver cerca de 1 cm de comprimento, mergulhe-a ou coloque a muda inteira em uma suspensão de 10,6 bactérias por mL em água por 1 minuto.
- Inocule a areia misturando as bactérias com a areia antes do plantio para obter uma concentração final de cerca de 103 bactérias por mL ou regando a muda com uma suspensão de 106 bactérias por mL após o plantio.
2. Incubação das bactérias com o material vegetal
- Para incubação em meio líquido, incube as bactérias com o material vegetal em água estéril ou sacarose e sais minerais ou meio de cultivo de tecido vegetal (como uma diluição 1:10 da mistura de sais basais Murashige e Skoog ou sais MS).
- Use um recipiente ao qual as bactérias não aderam. Tente manter a superfície da planta coberta continuamente, seja por submersão ou por agitação suave. Agitação vigorosa pode impedir a adesão ou até remover bactérias da superfície da planta.
- Observe o material vegetal no microscópio óptico após intervalos de tempo variados para determinar quando interromper a incubação e fazer medições. Um curso de adesão é frequentemente valioso, com amostras coletadas a cada 1 a 4 horas ou todos os dias, dependendo da velocidade da interação.
- Para incubar em areia, aplique as mesmas considerações descritas para incubação em meio líquido na etapa 2.1.
3. Medição de Adesão Usando Microscopia
- Faça medições microscópicas com Nomarski ou óptica de contraste de fase para facilitar a visualização das bactérias nas superfícies. No entanto, qualquer microscópio de campo claro com ampliação de 20X ou superior pode ser utilizado.
- Use observação microscópica para determinar se as bactérias estão distribuídas aleatoriamente ou localizadas em locais específicos. Além disso, verifique se estão ligados individualmente ou em grupos. Procure a presença de microcolônias que sugiram crescimento ou aprisionamento bacteriano após a aderência. Verifique se as bactérias parecem formar um biofilme na superfície.
NOTA: Um biofilme é um grande número de bactérias ligadas à superfície e cercadas por uma matriz extracelular. A estrutura pode ser lisa e uniforme ou ter uma arquitetura mais complexa. - Use bactérias marcadas com marcador fluorescente. Se outras bactérias estiverem presentes e as de interesse forem identificadas por uma etiqueta fluorescente, como a proteína fluorescente verde (GFP), utilize microscopia de fluorescência para determinar a presença das bactérias marcadas em aglomerados de outras bactérias. Para GFP, use um filtro com excitação de 490 nm e emissão de 520 nm.
- Verifique se a etiqueta fluorescente não está afetando negativamente as bactérias observando a adesão ao material axênico de uma mistura igual de bactérias do tipo selvagem e bactérias marcadas da mesma linhagem, utilizando ópticas Nomarski e de fluorescência. Se as bactérias fluorescentes e escuras estiverem misturadas aleatoriamente e presentes em número igual, então a marca não interferiu no ensaio.
- Determine o número de bactérias aderidas.
NOTA: É muito difícil determinar o número de bactérias anexadas no microscópio. Quando a ligação é feita a superfícies irregulares das plantas, geralmente não é possível obter uma medição quantitativa. Microscopia eletrônica de varredura (não discutida neste artigo) pode ser usada para realizar tais medições.- Quando as bactérias estão ligadas a uma superfície lisa, como um pelo radicular, conte o número de bactérias ligadas à borda do pelo radicular por mm de comprimento dos pelos radiculares. Tenha cuidado em usar pelos radiculares de tamanho e formato semelhantes ao comparar medidas.
- Para determinar o tamanho dos objetos no microscópio, use uma lâmina comercial com marcações medidas. Observe e fotografe esse slide nas mesmas configurações usadas para o material experimental e use as imagens resultantes para determinar o tamanho dos objetos nas fotomicrografias.
- Prepare a amostra para microscopia.
- Lave a amostra. Mova a amostra para uma gota de água ou meio de incubação em uma lâmina de microscópio e observe-a diretamente.
NOTA: Isso tem a vantagem de que, se não houver crescimento ou morte bacteriana real, é improvável que haja muitas bactérias livres. Considere a ausência de bactérias livres como um sinal de alerta de que pode ter havido morte bacteriana ou ligação bacteriana ao recipiente onde a incubação foi realizada. O efeito da lavagem da amostra é mostrado na Figura 1. - Lave a amostra delicadamente em água ou meio de incubação, colocando-a em um frasco com líquido e invertendo o frasco delicadamente. Depois, coloque a amostra na lâmina do microscópio em líquido fresco para observação.
- Monte a amostra em líquido usando uma lâmina comum de cobertura e uma lâmina de microscópio.
- Se a amostra for espessa e causar um volume sob a capa de proteção, use uma engobe de cobertura com press-apply. Essas lâminas de cobertura possuem um anel de borracha ou plástico ao redor da borda da lâmina de tampo. Coloque o líquido e a amostra no poço dentro do suporte de tampa e depois coloque o ferrolho por cima e pressione suavemente para selar o deslize de tampa ao lâmina. Inverta e examine.
- Alternativamente, use um deslizador de contagem de algas e um deslize de cobertura de forma semelhante. Note que lâminas com essa profundidade geralmente não podem ser examinadas com uma lente objetiva de ampliação superior a 20X.
