Formação de Grânulos de Estresse durante a infecção por Shigella em células epiteliais cancerígenas

Resumo

Fonte: Vonaesch, P. et. al., Análise de Imunofluorescência da Formação de Grânulos de Estresse após Desafio Bacteriano em Células de Mamíferos. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a infecção das células epiteliais pela bactéria patogênica Shigella flexneri e a resposta celular do hospedeiro resultante. Proteínas efetoras bacterianas interrompem a tradução do hospedeiro, desencadeando a formação de organelos sem membrana chamados grânulos de estresse, que refletem a resposta adaptativa da célula à infecção.

Protocolo

1. Preparação de Bactérias e Células do Hospedeiro

1. Transferir lâminas de cobertura de vidro de 12 ou 14 mm em placas de 24 ou 12 poços, respectivamente, com pinças estéreis, contando um poço por condição experimental. Esterilize esses por tratamento ultravioleta (UV) em um exaustor de cultura de tecidos por 15 minutos.
   NOTA: Inclua poços de controle para desafio bacteriano e para indução de grânulos de estresse (SG) por estresses exógenos.
2. Para uma placa de 24 poços com espingos de cobertura de 12 mm, semeie 1 x 10 5^{células de} mamíferos (por exemplo, células HeLa) em estalões de cobertura; Pressione as capas com uma ponta de pipeta estéril. Deixe as células aderirem durante a noite a 37 °C em uma incubadora de cultura de tecido com 5% de CO₂ , em meio de cultivo adequado para cada tipo celular.
   NOTA: Células de placas de modo que a confluência das células esteja entre 40 e 60% no dia seguinte.
   1. Para células HeLa, incube no meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco com aminoácidos não essenciais (NEAA) e soro fetal de bezerro (FCS) descomplementado com 10%. Descomplemente o FCS aquecendo por 30 minutos em banho-maria a 56 °C, girando o soro uma vez após 15 minutos.
3. Para eliminar bactérias, use uma ponta de pipeta estéril para remover uma pequena quantidade de um estoque de glicerol bacteriano (20% glicerol) armazenado em um freezer a -80 °C e coloque-o em um prato rotulado. Use um laço estéril para espalhar as bactérias por cerca de 10% da placa. Use um novo laço estéril e arraste pela mancha para formar 3 linhas paralelas, com metade de uma placa de comprimento. Passe por essas linhas, cobrindo o restante da placa. Incubar a placa O/N a 37 °C.
   1. Selecione uma única colônia bacteriana (por exemplo, Shigella flexneri) da placa recém-riscada. Evite trabalhar com colônias bacterianas com mais de 1 semana.
   2. Para a cepa M90T de S. flexneri , inocule uma colônia vermelha de uma placa de ágar vermelho Congo tricático recém-riscada, em 8 mL de caldo de soja tríptico em um tubo de 15 mL; Aperte a tampa e incube o tremor a 222 rpm O/N a 30 °C. ATENÇÃO: Não use colônias brancas grandes, pois elas perderam o plasmídeo de virulência e não são infecciosas.

2. Desafio Bacteriano das Células do Hospedeiro

1. Prepare bactérias para maximizar o potencial de infecção.
   1. Para S. flexneri, subcultive bactérias adicionando 150 μL de cultura O/N a 8 mL de ágar de soja tríptico e incube o shaking a 222 rpm a 37 °C até a fase exponencial tardia (~2 h) para induzir a expressão gênica de virulência e intensificar a infecção.
      1. Quando a cultura estiver em densidade óptica entre 0,6 e 0,9 (medida em 600 nm), transfira 1 mL de cultura para um tubo de 1,5 mL. Bactérias em pellet por 2 minutos a 8.000 x g e resuspendam no meio de infecção (DMEM com NEAA, sem FCS) em OD₆₀₀ = 1. Assim, se o OD₆₀₀ for 0,85, resuspenda em 850 μL.
         NOTA: Para S. flexneri, no OD₆₀₀ = 1, haverá 8 x 10⁸ bactérias por mL quando cultivadas em meio de 8 mL. Uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20 é apropriada. Para outros patógenos, o número de bactérias por mL em um OD₆₀₀ e o MOI apropriado precisam ser determinados empiricamente.
   2. Para potencializar as interações bactérias-hospedeiros, recubra as bactérias com poli-L-Lisina (PLL).
      NOTA: O tratamento com PLL de S. flexneri não teve efeito na dinâmica da SG. Outros patógenos precisam ser avaliados quanto à sua adequação ao tratamento com LLP.
      1. Para revestir as bactérias com PLL, centrifuge 1 mL de cultura bacteriana por 2 minutos a 8.000 x g e depois ressuspenda o pellet em 10 μg/mL de PLL em soro tampão fosfatado (PBS) a um OD₆₀₀ = 1.
      2. Adicione a solução bacteriana a um pequeno prato, como um poço dentro de uma placa de 12 poços, e incube em RT (~ 20 °C) por 10 minutos com uma agitação suave em um agitador de prato.
      3. Faça pellets de bactérias por 2 minutos a 8.000 x g, remova o excesso de PLL. Resuspenda o pellet em 1 mL de PBS e repita essa etapa de lavagem duas vezes. Após a lavagem final, ressuspenda no meio infectado em OD₆₀₀ = 1.
         NOTA: Aqui, o meio de infecção para S. flexneri é o meio da célula hospedeira com 20 mM de N-(2-Hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanossulfônico) (HEPES) sem FCS.
2. Prepare as células para o desafio bacteriano.
   1. Remova o meio das células HeLa de mamíferos usando uma bomba de sucção. Adicione 500 μL de meio celular HeLa RT para lavar as células, faça girar, remova o meio usando uma bomba de sucção e substitua por meio de infecção apropriado para temperatura ambiente (RT) de 500 μL (por exemplo, meio celular hospedeiro com 20 mM de HEPES sem FCS).
   2. NOTA: Para todas as etapas de lavagem, trabalhe rápido e processe apenas até 4 coberturas por vez para evitar que as células ressequen.
3. O desafio preparou células HeLa com bactérias para infectar 20 a 50% das células.
   NOTA: O tempo e o MOI apropriados precisam ser determinados para cada espécie bacteriana. Geralmente, um bom começo é de 30 minutos a 37 °C com um MOI de 10.
   1. Para S. flexneri, desafie as células HeLa usando um dos dois métodos (passo 2.3.1.1 ou 2.3.1.2).
      1. Centrifuge bactérias não tratadas com PLL (20 μL de OD₆₀₀ = 1/poço de placa de 24 poços em meio de 500 μL) sobre as células por 10 minutos a 13000 x g.
      2. Adicione bactérias revestidas com PLL (15 μL de OD₆₀₀ = 1/poço de placa de 24 poços em meio de 500 μL) por 15 minutos em RT para permitir que as bactérias se depositem nas células.
   2. Permita que a infecção ocorra colocando as células com bactérias depositadas em uma incubadora de cultura de tecido a 37 °C por 30 minutos.
      NOTA: Para períodos de tempo curtos, sincronize a infecção por S. flexneri colocando as placas em um banho-maria a 37 °C por 15 minutos, em vez de colocarem na incubadora de cultura de tecidos.
4. Prevenir infecção lavando células.
   1. Para lavar as células e remover o excesso de bactérias, remova o meio usando uma bomba de sucção, adicione 1 mL de meio de cultura HeLa pré-aquecido (DMEM, 10% FCS, NEAA). Mexa o médio, remova e substitua por meio novo. Repita duas vezes e deixe o meio fresco nas células.
      1. Para S. flexneri ou outras bactérias intracelulares, após a infecção das células HeLa e das lavagem, substitua-se o meio por meio padrão de cultura tecidual contendo 50 μg/mL gentamicina para eliminar bactérias extracelulares e prevenir uma invasão celular adicional.
         NOTA: Não adicione antibióticos ao meio para bactérias extracelulares.
5. Incube bactérias com células pelo tempo desejado em uma incubadora de cultura de tecidos.
   NOTA: Para S. flexneri, a infecção pode durar até 6 horas, dependendo do tipo celular. Para células HeLa, deixe a infecção prosseguir por 1,5 a 2 horas antes de adicionar estresses exógenos para induzir a formação de SG. Para infecções por Caco-2, nas quais Shigella se espalha de célula a célula, infeção por 30 minutos a 6 horas antes de adicionar estresse exógeno. As células podem ser fixadas neste ponto sem adicionar estresses exógenos para avaliar a formação de SGs como resultado da infecção bacteriana.

3. Análise de fixação e imunofluorescência da formação de grânulos de estresse

NOTA: Processe os revestimentos de controle e experimentais ao mesmo tempo para evitar diferenças de coloração que possam impactar a análise da imagem em etapas subsequentes. As amostras controle incluem não infecção com ou sem tratamento indutor de SG, e amostras infectadas com e sem tratamento indutor de SG.

1. Remova completamente o meio usando uma bomba de sucção e fixe as amostras adicionando 0,5 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% de RT no PBS. Incubar por 30 minutos em tempo de descanso.
   ATENÇÃO: A PFA é prejudicial ao manipulador e ao meio ambiente. Tome as medidas adequadas para proteger o manipulador e descartar resíduos químicos.
   NOTA: Alternativamente, fixe por 15 minutos e depois substitua por metanol pré-frio a -20 °C por 10 minutos para manter mais localização citoplasmática dos marcadores SG.
2. Remova o PFA com uma pipeta e descarte o líquido em um recipiente de resíduos apropriado. Lave o slip com 1 mL de soro salino tris-tamponado (TBS: 25 mM Tris, pH 7,3; 15 mM cloreto de sódio, NaCl). Incube o cobertor por 2 minutos com um sacudimento suave em um agitador de prato durante a lavagem.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Shigella flexneri			Disponível em vários laboratórios mediante solicitação
Caldo de soja com caseína de triptona (TCS)	BD em Biociências	211825	Meio de crescimento padrão para Shigella, aplicação - crescimento bacteriano
Ágar TCS	BD em Biociências	236950	Ágar padrão de crescimento para Shigella, aplicação - crescimento bacteriano
Congo vermelho	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Ferramenta de discriminação para Shigella que perdeu o plasmídeo de virulência, aplicação - crescimento bacteriano
Poli-L-Lisina (PLL)	Sigma-Aldrich	P1274	Útil para revestir bactérias e aumentar a infecção, aplicação - infecção
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397	Eliminação seletiva de bactérias extracelulares, mas não citosólicas, aplicação - infecção
HEPES	Tecnologias de Vida	15630-056	O tampão de pH é útil quando as células são incubadas em RT, aplicação - cultura celular
Eagle médio modificado (DMEM) de Dulbecco	Tecnologias de Vida	31885	Meio padrão de cultura para células HeLa, aplicação - cultura celular
Soro fetal para panturril (FCS)	Biowest	S1810-100	suplementação de 5% usada para meio de cultura celular HeLa, aplicação - cultura celular
Aminoácidos não essenciais (NEAA)	Tecnologias de Vida	11140	Diluição 1:100 usada para meio de cultura celular HeLa, aplicação - cultura celular
Dimetil sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Diluiente do reagente, aplicação - cultura celular
Paraformaldeído (PFA)	Cenas de Microscopia Eletrônica	15714	4% de PFA é usado para fixação padrão de células, aplicação - fixação
Placa de cultura celular de 24 poços	Sigma-Aldrich	CLS3527	Placas padrão de cultura de tecidos, aplicação - cultura celular
Coberturas de vidro de 12 mm	NeuVitro	1001/12	Suporte à cultura celular para aplicações imunofluorescentes, aplicação - suporte celular
Pinças	Sigma-Aldrich	81381	Meio de montagem barato e robusto que funciona bem para a maioria dos fluoróforos, aplicação - montagem