Imagem por fluorescência da colonização bacteriana em tecido renal de camundongos

Resumo

Fonte: Behera, R. K., et al. Um método baseado em fluorescência para estudar a regulação gênica bacteriana em tecidos infectados. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um método para preparar tecido renal de camundongos infectado, colorir DNA e detectar expressão gênica bacteriana usando repórteres fluorescentes duplos. O vermelho marca todas as bactérias, e o verde destaca células sensíveis a infecções.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de ética animal apropriado.

1. Colheita dos órgãos e processamento de tecidos
   1. Eutanasiar os animais por inalação de_CO2 e luxação cervical como método secundário, e realizar necropsia.
   2. Colhe o rim (à direita) e outros órgãos vitais (coração, fígado, pulmões, baço) e transfira para tubos de polipropileno de 15 mL contendo 10% [v/v] de formalina tamponada.
   3. Deixe os órgãos se fixarem no escuro, em temperatura ambiente, com sacudidas suaves ou rotação por pelo menos 24 horas, mas não mais que 48 horas.
   4. Incorpore os órgãos em um meio transparente de congelação de tecidos e armazene os tecidos a -80 °C.
   5. Usando um criostato, corte tecido em fatias de 10 μm de espessura.
   6. Seque as seções em um lâmina de vidro pré-limpo e carregado por 20 minutos no escuro. Aplique um meio de montagem rígido com corante 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e uma capa de cobertura. Cura monta as lâminas em temperatura ambiente durante a noite e transfere para 4 °C para armazenamento a longo prazo.
2. Microscopia Confocal de Varredura a Laser e Processamento de Imagem
   1. Examine lâminas montadas para localizar lesões usando lasers adequados para o repórter fluorescente utilizado. Nesse caso, são usados os sinais de fluorescência verde (GFP ou proteína fluorescente verde), vermelho (tdTomato) e azul (DAPI).
   2. Adquira a imagem usando o objetivo apropriado para visualizar células individuais (por exemplo, normalmente são usados objetivos 20x ou 40x).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
C57Bl/6 Mouses	Rio Charles	NA
Microscópio de varredura a laser confocal	Zeiss	NA
Microtomo de crióstato	Termo Científica	NA
Soro salino tamponado com fosfato (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Homogeneizador Precellys 24	Laboratórios Bertin	NA
Meio congelante de tecidos claros Sub Xero	Mercedes Medical	MER5000
Lâminas de microscópio Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Vectashield Meio de montagem Antifade com DAPI	Laboratórios Vector	H-1500