Imagens de Mudanças Morfológicas em Bactérias usando Microscopia de Fluorescência de Células Vivas

Resumo

Fonte: Brzozowski, R. S. et al. Microscopia de fluorescência de células vivas para investigar a localização de proteínas subcelulares e as alterações na morfologia celular em bactérias. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra microscopia de fluorescência de células vivas para visualizar mudanças morfológicas em tempo real nas bactérias. Ele descreve as etapas envolvidas na imagem, aquisição em time-lapse e deconvolução para obter imagens de alta resolução em tempo real.

Protocolo

1. Imagem

1. No dia do experimento, ligue o sistema de microscópio. Inicie o software de imagem (veja Tabela de Materiais) clicando no ícone apropriado na área de trabalho. Inicialize o microscópio clicando na opção Inicializar Microscópio (botão representado com um microscópio) na caixa de diálogo de inicialização do software. Certifique-se de que a objetiva esteja totalmente abaixada usando o ajuste grosseiro do microscópio antes da inicialização.
   NOTA: Após a inicialização, três caixas de diálogo adicionais devem aparecer além do menu iniciar: resolve3D, coleta de dados e monitor de filtro.
2. Coloque uma gota de óleo de 1,517 (índice de refração) sobre a meta de imersão de óleo 100x fornecida pelo fabricante (Abertura Numérica = 1,4, Distância de Trabalho = 0,12 mm; veja Tabela de Materiais).
   NOTA: É importante escolher o óleo de imersão adequado para a temperatura na qual a imagem é realizada.
3. Coloque a placa inferior de vidro contendo a amostra na carcaça metálica (caixão) e deslize suavemente para dentro da gramposa do palco.
4. Use o botão de ajuste grosso para elevar o objetivo até que o óleo entre em contato com o fundo do vidro do prato. Use a ocular e o botão de ajuste fino para focar a amostra. Quando as células estiverem em foco, gire o botão do ocular para o modo câmera movendo o seletor localizado na frente do corpo do microscópio para a esquerda.
5. Comece o experimento usando o software de imagem. Na janela resolve3D , selecione o ícone Design/execute experimento representado por um frasco. Uma nova caixa de diálogo deve aparecer chamada de experimento design/executar.
   1. Defina o número de Z-stacks e a espessura da amostra usando a aba de design e depois seção na caixa de diálogo design/execute experimento .
      NOTA: Para os experimentos na seção de resultados representativos, foram usados 17 Z-stacks com intervalo de 200 nm para imagens estáticas e quatro Z-stacks em intervalos de 200 nm para microscopia time-lapse.
   2. Para medir a espessura das células na amostra, ajuste manualmente o plano Z de forma incremental usando as setas para cima e para baixo na caixa de diálogo resolve3D . Marque onde as células ficam fora de foco como os limites superior e inferior para aquisição de imagem. Importe essas informações antes de executar o experimento.
   3. Para ajudar a minimizar a fototoxicidade e o fotobranqueamento durante a imagem em time-lapse, reduza o número de Z-stacks e escolha o plano médio das células para aquisição de imagem.
6. Selecione o conjunto de filtros apropriado para o experimento usando a aba de design e então canais na caixa de diálogo de design/execução do experimento (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
   1. Além disso, selecione uma referência para a coleta de informações POL/DIC. Ajuste a porcentagem de transmissão (intensidade da luz) e a duração da exposição para canais individuais selecionados antes da imagem, selecionando as opções apropriadas na caixa de diálogo resolve3D .
      NOTA: Em um campo de visão de teste que não é considerado para o experimento, teste essas configurações para identificar se os parâmetros selecionados obtêm dados significativos de fluorescência sem perder sinal fraco ou supersaturá-lo. Depois, importe esses parâmetros para o setup experimental.
7. Abra a lista de pontos selecionando o botão Lista de Pontos na caixa de diálogo resolve3D . Uma nova caixa de diálogo deve aparecer chamada lista de pontos. Marque vários campos de visão a serem usados no experimento encontrando campos de visão apropriados usando os controles do estágio do microscópio e selecionando a opção de marcar ponto na caixa de diálogo da lista de pontos.
   NOTA: Um ponto de substituição terá que ser selecionado cada vez que o microscópio for refocado em um ponto da lista de pontos. Isso pode ser feito focando o microscópio no ponto apropriado da lista e então selecionando o botão de substituir o ponto . É importante não tocar no botão analógico de ajuste grosso/fino ao refocar; Use apenas o software para ajustar o foco.
8. Defina os parâmetros de time-lapse selecionando primeiro a aba de design e depois de time-lapse na caixa de diálogo de projeto/execução do experimento. Selecione a caixa de seleção de time-lapse. Insira os parâmetros de time-lapse apropriados em termos de imagens de time-lapse/tempo total.
9. Defina pontos a serem imaginados a partir da lista de pontos selecionando primeiro a aba de design e depois de pontos na caixa de diálogo de design/execução do experimento. Selecione a opção de lista de pontos de visita e insira os pontos a serem imagados na caixa de texto separada por vírgulas ou hífens se for uma sequência completa.
10. Antes de iniciar um experimento, edite nomes e localizações de arquivos usando a aba de execução na caixa de diálogo de design/execução. A localização do arquivo pode ser alterada selecionando o botão de configurações , selecionando a pasta de dados e depois selecionando a pasta apropriada ou criando uma nova. Mude o nome dos arquivos inserindo o novo nome no quadro de texto do nome do arquivo imagem.
11. Comece o experimento selecionando o botão play na caixa de diálogo de iniciar experimento .
    NOTA: Para time-lapse, verifique continuamente o foco em cada campo de visão ao longo do experimento usando a configuração DIC (para evitar fotobranqueamento desnecessário) e refoque e atualize as informações na lista de pontos, pois as células tendem a sair de foco com o tempo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	Biorreagentes Fisher	BP160-100	Grau em Biologia Molecular - Baixo EEO
FM4-64	Invitrogen	T3166	Microscopia
Prato de fundo de vidro	MatTek	P35G-1.5-14-C	Microscopia
Microscópio	GE	DeltaVision Elite	Suporte personalizado para microscópio invertido Olympus IX-71; Torre de iluminação personalizada e módulo iluminador de luz transmitida. Objetivos: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X ÓLEO (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski para 100X Objectivo; Câmera CoolSnap HQ2; Conjunto SSI 7 cores; Câmara de controle ambiental - opaca.
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	Inibidor de FtsZ
SoftWorx	GE		Software de imagem fornecido pelo fabricante