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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.
1. Inoculação de Listeria monocytogenes em camundongos por meio de injeção em veias caudais e avaliação da carga bacteriana no fígado, baço e coração
NOTA: Todo o trabalho com animais é realizado de acordo com as diretrizes do CDC Biossafety Nível 2. Os ratos normalmente são encomendados com uma semana de antecedência e colocados em gaiolas junto com 5 animais por gaiola. Os camundongos são deixados se aclimatar ao novo ambiente de laboratório por quatro dias antes da injeção. Esses experimentos usaram fêmeas de camundongos Swiss-Webster de 6 a 8 semanas que foram alojadas de 5 por gaiola em um ambiente de barreira e alimentadas com uma dieta não restrita.
- Prepare uma gaiola de camundongos por vez, removendo a tampa e os compartimentos de comida/água, e coloque a gaiola sob uma lâmpada de aquecimento por cinco minutos. Esse processo permite que as veias caudais se dilatem, facilitando a realização das injeções.
- Retire um animal e coloque-o em um arnês (ou tubo de falcão com a ponta cortada) para imobilizá-lo durante a injeção.
- Limpe o local da injeção usando uma almofada de álcool e deixe o álcool evaporar. Isso não só limpa o local, mas também dilata ainda mais a veia caudal.
- Usando uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha calibre 27,5, injete suavemente o camundongo com 200 μl da cultura desejada na veia caudal.
- Use uma gaze para estancar qualquer sangramento que possa ocorrer como resultado da injeção e coloque o animal em uma gaiola nova.
- Repita esse processo para os animais e cepas restantes. Certifique-se de rotular cada gaiola com a cepa que receberam.
- Verifique os animais diariamente, removendo e sacrificando qualquer animal que pareça estar doente. Se nenhum animal apresentar sinais de doença, permita que as infecções persistam por 72 horas antes de sacrificar todos os animais.
- Para sacrificar, use anestesia de CO2 de uma fonte engarrafada até que todas as respirações parem, e então use deslocação cervical para garantir que o animal está morto.
- Após o sacrifício, mova os animais para um capuz de cultura de tecidos para dissecação.
- Usando um bloco de dissecação, prenda cada perna do animal com agulhas grandes e borrife o animal com etanol a 70% até que fique saturado.
- Corte a pele do abdômen e do tórax para trás usando uma incisão em forma de Y que se estende da abertura vaginal até o processo xifoide, progredindo depois até a axila de cada braço.
- Puxe a pele para trás e retire as agulhas de cada perna para manter a dissecação aberta.
- Corte suavemente o peritônio, expondo os intestinos, estômago, fígado e baço.
- Primeiro cortando a veia hepática e o ligamento coronal na parte superior do fígado, comece a remover o fígado. Ligamentos adicionais a serem removidos são encontrados abaixo do fígado, conectando-o à primeira seção do intestino delgado, assim como à musculatura das costas.
- Coloque o fígado em 5 ml de ddH20 estéril em um tubo falcão de 50 ml.
- Em seguida, remova o baço isolando-o e cortando suavemente os vasos e ligamentos. O baço será removido mais facilmente do que o fígado. Coloque o baço em um tubo falcão separado contendo 5 ml de ddHestéril 20.
- Localize o diafragma e corte suavemente ao longo da caixa torácica para visualizar o tórax. Corte o processo xifoide e o esterno até o nível do pescoço para abrir o tórax, expondo o coração e os pulmões.
- Usando pinças, segure o coração suavemente pelo ápice e levante-o de modo que a aorta e os vasos pulmonares fiquem em tensão. Corte esses vasos para libertar o coração.
- Coloque o coração em um tubo falcon de 50 ml contendo 5 ml de ddH20estéril.
- Descarte a carcaça do camundongo e repita esse processo para cada animal, usando tubos limpos de falcão contendo 5 ml de ddH20 estéreis para cada órgão removido.
- Depois que todos os órgãos forem removidos, limpe a estação de trabalho e volte para a bancada.
- Prepare um conjunto de 5 tubos para ser usado na limpeza e esterilização do homogeneizador para cada conjunto de órgãos de cinco camundongos (ou seja, um conjunto de 5 tubos para 5 fígados, 5 tubos para 5 baços e 5 tubos para 5 corações). Quatro de cada tubo devem ser preenchidos com 30 ml de ddHestéril 20, e um deve ser preenchido com 30 ml de EtOH 90%.
- Usando um TissueMaster (ou homogeneizador equivalente), mergulhe o homogeneizador (enquanto está em funcionamento) nos tubos preparados no passo 1.21 da seguinte forma para limpar a sonda:
- Tubo 1 (ddH2O) 5 seg no Tubo 2 (ddH2O) 5 seg no Tubo 3 (EtOH) 5 segundos no Tubo 4 (ddH2O) 5 segundos no Tubo 5 (ddH2O)
- Homogeneize um fígado usando o homogeneizador por pelo menos 2 minutos, ou até que não restem porções visíveis do órgão. Use uma pinça para remover qualquer detrito grande da sonda.
- Repita o processo de limpeza descrito.
- Repita o processo de homogeneização para os outros fígados, certificando-se de lavar a sonda entre cada fígado usando o processo descrito.
- Depois que todos os fígados estiverem completamente homogeneizados, descarte os tubos de lavagem (1-5) para o fígado.
- Repita o processo de homogeneização/limpeza tanto para o baço quanto para o coração, certificando-se de usar um novo conjunto de tubos de lavagem para cada série de órgãos. Se em algum momento os tubos de lavagem ficarem turvos, descarte-os e substitua por tubos novos para finalizar a série.
- Depois que todos os órgãos estiverem homogeneizados, faça um último ciclo de limpeza no homogeneizador e seque bem para armazenamento.
- Coloque aproximadamente 200 μl de cada órgão em um poço individual de uma placa de 96 poços.
- Realize diluições seriadas nas amostras de órgãos diluindo 1:10 em uma série até uma diluição 1:10.000 (fígado e baço) ou até uma diluição 1:1.000 (coração).
- Placar a série de diluição em lágar LB pré-aquecido. Também remova 20 ul de cada órgão não diluído e placas em placas separadas de ágar LB para enumerar a CFU de órgãos mal colonizados.
- Descarte os tubos falcão contendo os órgãos homogeneizados e envolva as placas de 96 poços contendo a série de diluição com parafilme, colocando-os em uma caixa de congelação a -80 °C.
- Deixe as manchas secarem. Esse processo é acelerado colocando as placas no capuz e removendo as tampas.
- Depois que as manchas secarem, coloque as placas em uma incubadora a 37 °C durante a noite.
- Conte o número de colônias em cada ponto na manhã seguinte e use a série de diluição para calcular o número total de bactérias por órgão.