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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de ética animal apropriado.
1. Infecção
- Adquira camundongos BALB/c de ambos os sexos entre 10 e 12 semanas de idade.
NOTA: A cepa TIGR4 de Streptococcus pneumoniae sorotipo 4 é um isolado clínico virulento que foi sequenciado. - Cultive TIGR4 em caldo Todd-Hewitt a 37 °C em 5% deCO2 até atingir uma densidade óptica (OD)620 de 0,5 (correspondente a 1,0 x10 8 unidades formadoras de colônia [CFU]/ml). Faça pellets na cultura pneumocócica por centrifugação por 10 minutos a 3.500 x g e remova o sobrenadante usando uma linha de vácuo. Suspenda e dilua as bactérias com soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS) até uma concentração final de 1,0 x 104 UFC/ml.
- Usando uma câmara de indução, anestesiamos camundongos com 2,5% de isoflurano vaporizado em oxigênio. Confirme o estado anestesiado com uma leve pinçada no dedo do pé com uma pinça romba.
- Segurando o camundongo anestesiado pela barba e em pé com uma mão, injeta cada camundongo intraperitonealmente (i.p.) com 100 μl da suspensão de S. pneumoniae usando uma seringa com agulha calibre 27-30 (correspondente a uma dose de desafio de 1,0 x 103 UFC). Coloque o rato de volta na gaiola. Os camundongos normalmente acordam de 30 a 40 segundos após a injeção.
- Deixe a infecção se estender por pelo menos 24 (no início) ou 30 (avançados) horas.
- Eutanasiar os camundongos por asfixia de CO2 . Realize uma luxação cervical para garantir que o camundongo tenha falecido. A eutanásia é ainda confirmada pela remoção do coração no Passo 1.6.
- Desinfete a cauda com um swab de álcool e corte uma seção de 2-3 mm. Colete 2 μl de sangue e dilua o sangue em série 10 vezes em PBS contendo heparina de sódio 1 U/ml cinco vezes. Diluições seriadas em placas em uma placa de ágar sanguíneo tríptico de soja e incubação durante a noite a 37 °C em 5% deCO2. No dia seguinte, extrapolam a partir da colônia o nível de bacteriemia.
- Imobilize o rato em posição supina sobre uma plataforma cirúrgica. Borrife o peito com etanol 70% e seco com tamponadas. Usando tesoura cirúrgica e pinças, abra a cavidade torácica, remova a caixa torácica e corte o diafragma para expor o coração e os pulmões. Com tesoura, corte os vasos sanguíneos conectados ao coração e retire cuidadosamente o coração com cuidado para evitar hematomas com pinça.
- Enxágue o coração com PBS e depois coloque-o em cassetes de coleta de amostras de tecido para que as seções coronais sejam obtidas durante a secção do tecido. Para a incorporação de parafina, coloque as cassetes em solução de formalina buffeada a 10% e, no dia seguinte, peça a incorporação de parafina.
- Alternativamente, congelamento repentino usando composto de temperatura de corte ideal (O.C.T.) dentro de um criomold colocado sobre gelo seco.
2. Visualização de Lesões Cardíacas e Pneumococos dentro das Lesões
- Corte as seções do coração embutidas com parafina de modo que as 4 câmaras do coração fiquem visíveis em cada seção de tecido. Corte lâminas com espessura de 5 μm.
- Desparafinize e colora as lâminas com hematoxilina & eosina (H&E) usando métodos padrão.
- Observe seções cardíacas coradas com H&E usando um microscópio óptico em ampliações baixas (100X, 200X) e altas (imersão em óleo: 400X, 1.000X). Caracterize corações pela presença de microlesões no miocárdio. Aqui, adquira imagens H&E usando um microscópio Zeiss Axioskop 2 equipado com um objetivo de abertura numérica Plan-NEOFLUAR de 100X 1.3.
NOTA: Nos estágios iniciais, as lesões cardíacas são diferenciadas pela aparência de cores diferentes e, em alguns casos, pela presença de células imunes (monócitos e granulócitos), que parecem ser monócitos. Em lesões avançadas, especialmente aquelas observadas às 30 horas, células imunes estão ausentes, e grandes lesões semelhantes a vacúolo são observadas em seu lugar. É importante notar que, embora o influxo de células imunes durante os estágios iniciais do desenvolvimento da lesão cardíaca possa ocorrer, não parece ser uma exigência.