Imunocoloração de microlesões preenchidas com bactérias em uma seção de tecido cardíaco de camundongo para imagem

Resumo

Fonte: Brown, A. O., e Orihuela, C. J. Visualização de Streptococcus pneumoniae em Microlesões Cardíacas e Remodelação Cardíaca Subsequente. J. Vis. Exp. (2015)

O vídeo demonstra a imunocoloração de seções de tecido cardíaco de camundongos fixadas quimicamente para visualizar bactérias patogênicas localizadas em microlesões induzidas por infecção. O processo inclui lavagem de tecidos, permeabilização de membranas, bloqueio de sítios inespecíficos, marcação de anticorpos, contracoloração nuclear e microscopia confocal para detectar e localizar aglomerados bacterianos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de ética animal apropriado.

1. Infecção

1. Adquira camundongos BALB/c de ambos os sexos entre 10 e 12 semanas de idade.
   NOTA: A cepa TIGR4 do Streptococcus pneumoniae sorotipo 4 é um isolado clínico virulento que foi sequenciado.
2. Cultive TIGR4 em caldo Todd-Hewitt a 37 °C em 5% de_CO-2 até que a cultura atinja uma densidade óptica de 620 nm (OD₆₂₀) de 0,5 (correspondente a 1,0 × 10 unidades formadoras^{de 8} colônias [UFC]/ml). Faça pellets na cultura pneumocócica por centrifugação por 10 minutos a 3.500 × g e remova o sobrenadante usando uma linha de vácuo. Suspenda e dilua as bactérias com soro salino tamponado com fosfato estéril (PBS) até uma concentração final de 1,0 × 10⁴ UFC/ml.
3. Usando uma câmara de indução, anestesiamos camundongos com 2,5% de isoflurano vaporizado em oxigênio. Confirme o estado anestesiado com uma leve pinçada no dedo do pé com uma pinça romba.
   1. Segurando o camundongo anestesiado pela barba e em pé com uma mão, injeta cada camundongo intraperitonealmente (i.p.) com 100 μl da suspensão de S. pneumoniae usando uma seringa com agulha calibre 27-30 (correspondente a uma dose de desafio de 1,0 × 10³ CFU). Coloque o rato de volta na gaiola. Os camundongos normalmente acordam de 30 a 40 segundos após a injeção.
4. Deixe a infecção se estender por pelo menos 24 (no início) ou 30 (avançados) horas.
   1. Eutanasia os camundongos por asfixia por CO2. Realize uma luxação cervical para garantir que o camundongo tenha falecido. A eutanásia é ainda confirmada pela remoção do coração no Passo 1.6.
5. Desinfete a cauda com um swab de álcool e corte uma seção de 2-3 mm. Colete 2 μl de sangue e dilua o sangue em série 10 vezes em PBS contendo heparina de sódio 1 U/ml cinco vezes. Diluições seriadas em placas em uma placa de ágar sanguíneo de soja tríptica e incubam durante a noite a 37 °C em 5% de CO2. No dia seguinte, extrapolam a partir da colônia o nível de bacteriemia.
6. Imobilize o rato em posição supina sobre uma plataforma cirúrgica. Borrife o peito com etanol 70% e seco com tamponadas. Usando tesoura cirúrgica e pinças, abra a cavidade torácica, remova a caixa torácica e corte o diafragma para expor o coração e os pulmões. Com tesoura, corte os vasos sanguíneos conectados ao coração e retire cuidadosamente o coração com cuidado para evitar hematomas com pinça.
7. Enxágue o coração com PBS e depois coloque-o em cassetes de coleta de amostras de tecido para que as seções coronais sejam obtidas durante a secção do tecido. Para a incorporação de parafina, coloque as cassetes em solução de formalina buffeada a 10% e, no dia seguinte, peça a incorporação de parafina.
   1. Alternativamente, congelamento repentino usando a Temperatura Ótima de Corte (O.C.T.) Composto dentro de um criomold que foi colocado sobre gelo seco.

2. Visualização de Lesões Cardíacas e Pneumococos dentro das Lesões

1. Corte as seções do coração embutidas com parafina de modo que as 4 câmaras do coração fiquem visíveis em cada seção de tecido. Corte lâminas com espessura de 5 μm.
2. Desparafinize e colora as lâminas com hematoxilina & eosina (H&E) usando métodos padrão.
3. Veja seções cardíacas coradas com H&E usando um microscópio óptico em ampliações baixas (100×, 200×) e altas (imersão em óleo: 400×, 1.000×). Caracterize corações pela presença de microlesões no miocárdio. Aqui, adquira imagens H&E usando um microscópio Zeiss Axioskop 2 equipado com um objetivo de abertura numérica Plan-NEOFLUAR de 100× 1,3.
   NOTA: Nos estágios iniciais, lesões cardíacas são diferenciadas pela aparência de cores diferentes e, em alguns casos, pela presença de células imunes (monócitos e granulócitos), que parecem ser monócitos. Em lesões avançadas, especialmente aquelas observadas às 30 horas, células imunes estão ausentes, e grandes lesões semelhantes a vacúolo são observadas em seu lugar. É importante notar que, embora o influxo de células imunes durante os estágios iniciais do desenvolvimento da lesão cardíaca possa ocorrer, não parece ser uma exigência.

3. Microscopia Imunofluorescente para Pneumococos em Microlesões

1. Divida o coração em crioformas com um micrótomo até uma espessura de 5 μm e coloque as seções sobre lâminas de vidro carregadas positivamente. Deixe as seções cardíacas congeladas descongelarem e secarem ao ar. Fixe as seções por 10 minutos em formalina tamponada neutra a 10% (pH 6,8-7,2 a 25 °C).
2. Lave as lâminas (3×) em PBS por 5 minutos, permeabilize por 15 minutos em 0,2% Triton X-100 em PBS, depois lave novamente em PBS.
3. Bloquee a seção de tecido em lâminas com soro de cabra 10% em PBS por 1 hora.
4. Enxague as lâminas com PBS, cubra e incube as seções cardíacas com antissoro anti-serotipo 4 contra pneumococo de coelho a 1:1.000 em PBS com soro de cabra a 10% por 2 horas a 37 °C.
   NOTA: Para controles negativos, os investigadores devem usar antisoro de coelho naïve
5. Após lavar com PBS, cubra e incube as seções com 10% de soro de cabra - PBS com anticorpo conjugado de Fluoresceína Isotiocianato (FITC) anti-coelho a 1:2.000 por 30 minutos a 37 °C.
6. Seguindo as instruções do fabricante, use DAPI (4',6- Diamidino-2-Fenilindol) a 5 mg/ml para visualização dos núcleos eucarióticos. Lave e monte as seções de tecido com FluorSave.
7. Adquira imagens fluorescentes usando um sistema de microscópio confocal em baixa e alta ampliação. Ajuste a abertura numérica de acordo para obter resultados ideais. Aqui, adquira imagens fluorescentes usando um sistema confocal com objetivo numérico de abertura de 60× 1,42.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caldo Todd-Hewitt	Neogen	7161A
Complexo O.C.T.	Tecido-Tecido (Sakura Finetek)	4583
Triton X-100	Fisher Scientific (Acros)	9002-93-1
Soro Normal de Cabra	Abcam	ab7481
Antissoro anti-serotipo 4 contra pneumococo	Instituto de Soro Statens	16747
Anticorpo conjugado anti-coelho de cabra	Jackson ImmunoResearch	111-096-144
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluorsave	Millipore	345789
Permount	Fisher Scientific	S70104
Ampicilina	Sigma	A9393
Lâminas de microscópio Tissue Tack	Polysciences, Inc	24216
Pomada Paralube Vet	Dechra	12920060
Kit de Coloração de Hematoxilina e Eosina	não especificado		Padrão