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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de ética animal apropriado.
1. Infecção
- Adquira camundongos BALB/c de ambos os sexos entre 10 e 12 semanas de idade.
NOTA: A cepa TIGR4 do Streptococcus pneumoniae sorotipo 4 é um isolado clínico virulento que foi sequenciado. - Cultive TIGR4 em caldo Todd-Hewitt a 37 °C em 5% deCO-2 até que a cultura atinja uma densidade óptica de 620 nm (OD620) de 0,5 (correspondente a 1,0 × 10 unidades formadorasde 8 colônias [UFC]/ml). Faça pellets na cultura pneumocócica por centrifugação por 10 minutos a 3.500 × g e remova o sobrenadante usando uma linha de vácuo. Suspenda e dilua as bactérias com soro salino tamponado com fosfato estéril (PBS) até uma concentração final de 1,0 × 104 UFC/ml.
- Usando uma câmara de indução, anestesiamos camundongos com 2,5% de isoflurano vaporizado em oxigênio. Confirme o estado anestesiado com uma leve pinçada no dedo do pé com uma pinça romba.
- Segurando o camundongo anestesiado pela barba e em pé com uma mão, injeta cada camundongo intraperitonealmente (i.p.) com 100 μl da suspensão de S. pneumoniae usando uma seringa com agulha calibre 27-30 (correspondente a uma dose de desafio de 1,0 × 103 CFU). Coloque o rato de volta na gaiola. Os camundongos normalmente acordam de 30 a 40 segundos após a injeção.
- Deixe a infecção se estender por pelo menos 24 (no início) ou 30 (avançados) horas.
- Eutanasia os camundongos por asfixia por CO2. Realize uma luxação cervical para garantir que o camundongo tenha falecido. A eutanásia é ainda confirmada pela remoção do coração no Passo 1.6.
- Desinfete a cauda com um swab de álcool e corte uma seção de 2-3 mm. Colete 2 μl de sangue e dilua o sangue em série 10 vezes em PBS contendo heparina de sódio 1 U/ml cinco vezes. Diluições seriadas em placas em uma placa de ágar sanguíneo de soja tríptica e incubam durante a noite a 37 °C em 5% de CO2. No dia seguinte, extrapolam a partir da colônia o nível de bacteriemia.
- Imobilize o rato em posição supina sobre uma plataforma cirúrgica. Borrife o peito com etanol 70% e seco com tamponadas. Usando tesoura cirúrgica e pinças, abra a cavidade torácica, remova a caixa torácica e corte o diafragma para expor o coração e os pulmões. Com tesoura, corte os vasos sanguíneos conectados ao coração e retire cuidadosamente o coração com cuidado para evitar hematomas com pinça.
- Enxágue o coração com PBS e depois coloque-o em cassetes de coleta de amostras de tecido para que as seções coronais sejam obtidas durante a secção do tecido. Para a incorporação de parafina, coloque as cassetes em solução de formalina buffeada a 10% e, no dia seguinte, peça a incorporação de parafina.
- Alternativamente, congelamento repentino usando a Temperatura Ótima de Corte (O.C.T.) Composto dentro de um criomold que foi colocado sobre gelo seco.
2. Visualização de Lesões Cardíacas e Pneumococos dentro das Lesões
- Corte as seções do coração embutidas com parafina de modo que as 4 câmaras do coração fiquem visíveis em cada seção de tecido. Corte lâminas com espessura de 5 μm.
- Desparafinize e colora as lâminas com hematoxilina & eosina (H&E) usando métodos padrão.
- Veja seções cardíacas coradas com H&E usando um microscópio óptico em ampliações baixas (100×, 200×) e altas (imersão em óleo: 400×, 1.000×). Caracterize corações pela presença de microlesões no miocárdio. Aqui, adquira imagens H&E usando um microscópio Zeiss Axioskop 2 equipado com um objetivo de abertura numérica Plan-NEOFLUAR de 100× 1,3.
NOTA: Nos estágios iniciais, lesões cardíacas são diferenciadas pela aparência de cores diferentes e, em alguns casos, pela presença de células imunes (monócitos e granulócitos), que parecem ser monócitos. Em lesões avançadas, especialmente aquelas observadas às 30 horas, células imunes estão ausentes, e grandes lesões semelhantes a vacúolo são observadas em seu lugar. É importante notar que, embora o influxo de células imunes durante os estágios iniciais do desenvolvimento da lesão cardíaca possa ocorrer, não parece ser uma exigência.
3. Microscopia Imunofluorescente para Pneumococos em Microlesões
- Divida o coração em crioformas com um micrótomo até uma espessura de 5 μm e coloque as seções sobre lâminas de vidro carregadas positivamente. Deixe as seções cardíacas congeladas descongelarem e secarem ao ar. Fixe as seções por 10 minutos em formalina tamponada neutra a 10% (pH 6,8-7,2 a 25 °C).
- Lave as lâminas (3×) em PBS por 5 minutos, permeabilize por 15 minutos em 0,2% Triton X-100 em PBS, depois lave novamente em PBS.
- Bloquee a seção de tecido em lâminas com soro de cabra 10% em PBS por 1 hora.
- Enxague as lâminas com PBS, cubra e incube as seções cardíacas com antissoro anti-serotipo 4 contra pneumococo de coelho a 1:1.000 em PBS com soro de cabra a 10% por 2 horas a 37 °C.
NOTA: Para controles negativos, os investigadores devem usar antisoro de coelho naïve - Após lavar com PBS, cubra e incube as seções com 10% de soro de cabra - PBS com anticorpo conjugado de Fluoresceína Isotiocianato (FITC) anti-coelho a 1:2.000 por 30 minutos a 37 °C.
- Seguindo as instruções do fabricante, use DAPI (4',6- Diamidino-2-Fenilindol) a 5 mg/ml para visualização dos núcleos eucarióticos. Lave e monte as seções de tecido com FluorSave.
- Adquira imagens fluorescentes usando um sistema de microscópio confocal em baixa e alta ampliação. Ajuste a abertura numérica de acordo para obter resultados ideais. Aqui, adquira imagens fluorescentes usando um sistema confocal com objetivo numérico de abertura de 60× 1,42.