Detecção por PCR de patógenos transmitidos por alimentos a partir de amostras enriquecidas de moscas

Resumo

Fonte: Pava-Ripoll, et al. Detecção de patógenos bacterianos transmitidos por alimentos em moscas individuais da sujeira. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra um método baseado em PCR que amplifica o DNA bacteriano alvo de amostras de moscas enriquecidas usando comprimidos específicos para patógenos, permitindo a detecção de fluorescência em tempo real e a análise da curva de fusão para confirmar a presença de patógenos transmitidos por alimentos em insetos individuais.

Protocolo

1. Comprimidos prontos para PCR hidratado (reação em cadeia da polimerase)

1. Selecione um bloco de resfriamento para PCR gelado (4 °C) e coloque um suporte para tubos de PCR sobre o inserto.
2. Coloque os tubos de PCR correspondentes contendo os comprimidos prontos para PCR (incluídos em cada kit) para o patógeno alimentar alvo no suporte, de acordo com o arquivo do rack.
3. Usando a ferramenta de descapsulação, remova cuidadosamente as tampas dos tubos de PCR. Descarte as tampas e verifique se cada tubo contém um comprimido.
4. Transfira 50 μl (para Salmonella e Cronobacter) ou 30 μl (para L. monocytogenes) de lisado para tubos PCR específicos. Use novos capacitores ópticos e fixe-os firmemente nos tubos de PCR usando a ferramenta de tapagem.
   NOTA: Após adicionar o lisato a comprimidos prontos para PCR, as amostras devem permanecer resfriadas a 2 - 8 °C até serem carregadas no sistema de detecção baseado em PCR. Os tubos de PCR podem ser centrifugados a 2.500 x g por alguns segundos para garantir que o volume total esteja no fundo do tubo.
5. Carregue os tubos de PCR no instrumento do sistema de detecção de PCR abrindo a gaveta do instrumento.
6. Coloque o suporte de tubos de PCR nos poços da gaveta e verifique se os tubos estão corretamente encaixados.
7. Feche a gaveta e inicie o programa conforme descrito pelo protocolo do fabricante.
   NOTA: O instrumento baseado em PCR possui parâmetros de ciclo pré-definidos para cada patógeno transmitido por alimentos.
8. Verifique se a barra de status do ciclo da PCR exibe uma barra azul indicando que a parte de amplificação do programa está rodando.
   NOTA: Para ensaios padrão de PCR, o tempo de processamento do programa completo (amplificação e detecção) leva aproximadamente 3 a 3,5 horas para ser concluído.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ferramenta de cobertura	DuPont	D11677028
Ferramenta de desapamento	DuPont	D11134095
Rack/suporte de tubos de PCR	DuPont	D12701663
Ponta fina, pinças de ponta reta	BioQuip	4731	Esterilize antes de usar. Múltiplos fornecedores.
Bloco de resfriamento			Múltiplos fornecedores.
Centrífuga			Múltiplos fornecedores.