Um ensaio rápido baseado em imagem para triagem de virulência bacteriana induzida por superfícies

Resumo

Fonte: Perinbam, K., e Siryaporn, A. Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseado em imagem usando ameba. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra um método rápido baseado em imagens para avaliar a virulência bacteriana, incubando amebas com bactérias presas à superfície ou planctônicas, aplicando uma pastilha de agarose de calceína-acetoximetil (calceína-AM) e imagens de fluorescência para detectar danos à célula hospedeira.

Protocolo

1. Microscopia - Preparação da pastilha de ágar

1. Prepare as almofadas de ágar cerca de 30 minutos a 1 hora antes das amebas estarem prontas para serem misturadas com Pseudomonas aeruginosa.
2. Micro-ondas 50 mL de ágar de 1% (p/v) em tampão de desenvolvimento (DB) em um frasco de 250 mL. Misture a cada 20 segundos até que os tufos de ágar desapareçam.
3. Resfrie o ágar derretido colocando-o em um banho-maria pré-aquecido a 55 °C por 15 minutos.
4. Adicione 15 μL da solução de calceína-AM em 15 mL do ágar fundido em um tubo cônico. Misture invertendo suavemente o tubo 4 a 5 vezes e proceda imediatamente para a próxima etapa.
   NOTA: Realize essa etapa em um tubo de centrífuga de polipropileno de 15 mL. Não use um recipiente de vidro grosso, pois isso fará o ágar solidificar rápido demais.
5. Despeje a mistura de ágar derretido sobre uma placa de vidro de 12 cm x 10 cm e deixe o ágar solidificar por 10 minutos em temperatura ambiente. Corte a placa de ágar solidificada em seções menores, de 1,5 cm x 1,5 cm, colocando a placa de vidro sobre uma grade impressa e cortando ao longo da grade usando uma régua de metal.
6. Mantenha o gel hidratado em uma caixa úmida até que esteja pronto para uso.

2. Microscopia - Preparação da amostra de bactérias-amebas para imagem

1. Para testar a virulência das células bacterianas presas à superfície, adicione 10 μL de células de ameba às bactérias presas à superfície.
   NOTA: Essa etapa descreve a mistura de amebas com bactérias.
2. Para testar a virulência das células planctônicas, misture 10 μL de células de ameba com 10 μL de bactérias planctônicas.
   NOTA: Não lave as células de ameba desenvolvidas xénicamente (em um OD₆₀₀ de 0,2 a 0,5) antes de misturar com as bactérias. Não será observado crescimento de E. coli na cultura de ameba devido ao uso da solução antibiótica-antimicótica.
3. Imediatamente coloque a almofada de ágar de calceína-AM de 1,5 cm x 1,5 cm do passo 1,5 sobre a mistura de bactérias e amebas na superfície da placa de Petri.
   NOTA: Coloque a pastilha de ágar sobre a mistura usando um movimento rápido e suave. Não abaixe a almofada lentamente sobre a mistura, pois esse movimento tende a empurrar as células para a periferia e para longe da parte inferior da almofada. Essa etapa garantirá que bactérias e amebas estejam uniformemente misturadas, imobilizadas e que ambos os tipos celulares fiquem confinados ao mesmo plano.
4. Remova o excesso de líquido pipetando suavemente qualquer líquido restante ao redor da almofada de ágar. Deixe a placa de Petri secar por 20 minutos em temperatura ambiente.
5. Cubra a placa de Petri com uma tampa e incube a mistura imobilizada de ameba e bactéria em temperatura ambiente por mais 40 minutos. Prossiga para o passo 3.1.
   NOTA: É importante incubar todas as amostras pelo mesmo período, pois a fluorescência de fundo aumenta com o tempo. Recomenda-se um tempo de incubação de 1 hora. Incubações por mais de 1 h são menos reprodutíveis, pois as células de amebas podem começar a se romper.

3. Microscopia - Aquisição de Imagem

1. Imageie amebas usando um microscópio de fluorescência capaz de adquirir imagens de campo claro e fluorescência verde. Para fluorescência verde, utilize filtros de proteína de fluorescência verde (GFP) com 474/27 nm e 525/45 nm para excitação e emissão, respectivamente. Use um objetivo de 10X (abertura numérica ≥0,3) para obter imagens das amebas.
   NOTA: A calcieína-AM no ágar fará com que amebas moribundas fluorescam no canal de fluorescência verde. Amebas saudáveis não são fluorescentes.
2. Ajuste os tempos de aquisição para o contraste de fase, canais GFP para limitar a fototoxicidade e otimizar a faixa dinâmica das intensidades da imagem. Substitua o contraste de fase do contraste diferencial de interferência (DIC) se necessário.
   NOTA: Use exposições de 100 a 200 ms para contraste de fase e fluorescência GFP, se possível. Mantenha a exposição e as configurações do instrumento inalteradas durante todo o experimento. Isso é fundamental para calcular o índice de eliminação do hospedeiro.
3. Adquira imagens de pelo menos 100 células de ameba para obter boas estatísticas para calcular o índice de morte do hospedeiro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
Bacto ágar, desidratado	BD Difco	214010
Antibiótico-Antimicoótico (100X)	Tecnologias de Vida	15240062	A alíquota < 1 mL e armazenada a -20 °C
Éster de calceína-acetoximetil (calceína-AM)	Tecnologias de Vida	C34852	Calceína Acetoximetil (AM)
Cloreto de cálcio, anidro	Sigma-Aldrich	C1016
D-Glicose	Fisher Chemical	D16500	Dextrose
Dimetil sulfóxido	Sigma-Aldrich	D5879
Ácido fólico	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	M8266
Extrato de levedura	Oxoide	LP0021
Peptone especial	Oxoide	LP0072
Hiróxido de potássio	Fisher Chemical	P250
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	P0662
Fosfato de sódio dibásico heptahidratado	Fisher Chemical	S373
Vitamina B12	Sigma-Aldrich	V2876
Cepas
Discoideum de dictyostelium	Laboratório Siryaporn	Strain AX318
Escherichia coli	Laboratório Siryaporn	Cepa B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Laboratório Siryaporn	PA14	Cepa PA14
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Laboratório Siryaporn	AFS20.1	Cepa 20 derivada do PA14
Suprimentos
Filtro de 0,22 μm	Millipore	SCGPT01RE	Para esterilização com filtro
Tubo cônico, 15 mL	Corning	352097
Garrafas de vidro para armazenamento	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Placa de Petri, 6 cm de diâmetro	Corning	351007	Placas de poliestireno de 60 x 15 mm
Placa de Petri, 10 cm de diâmetro	Fisher	FB0875712	Placas de poliestireno de 100 x 15 mm
Recipientes plásticos com tampa	Ziploc	2.57E+09	Recipientes quadrados de 3 xícaras
Placas de vidro	Bio-Rad	1653308	Para preparar almofadas de ágar. Outras placas de vidro podem ser usadas com dimensões semelhantes.
Bastões de madeira	Fisher	23-400-102
Equipamento
Microscópio Eclipse Ti-E	Nikon	MEA53100	Configuração do microscópio
10X Plan Fluor Ph1 objetivo 0,3 NA	Nikon	MRH20101	Configuração do microscópio
Fonte de excitação por fluorescência	Lumencor	Motor leve Sola	Configuração do microscópio
Conjunto de filtros de fluorescência	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Configuração do microscópio
Câmera Orca Flash 4.0 V2	Hamamatsu	77054098	Configuração do microscópio
ImageJ	NIH	v. 1.49	Software para análise de imagens
MATLAB	Mathworks	R2013	Software para análise de imagens
Incubadora de shaker orbital	VWR	89032-092	Para crescimento de bactérias a 37 °C
Agitador de plataforma	Fisher	13-687-700	Para crescimento de amebas a 22 °C
Espectrofotômetro	Biochrom	Ultrospec 10
Incubadora refrigerada sob o balcão	Fisher	97990E	Para crescimento de amebas a 22 °C
Banho-maria isotemp	Fisher	15-462-21Q	Para meio de resfriamento a 55 °C