Um ensaio rápido baseado em imagem para triagem de virulência bacteriana induzida por superfícies

Resumo

Fonte: Perinbam, K., e Siryaporn, A. Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseado em imagem usando ameba. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra um método rápido baseado em imagens para avaliar a virulência bacteriana, incubando amebas com bactérias presas à superfície ou planctônicas, aplicando uma pastilha de agarose de calceína-acetoximetil (calceína-AM) e imagens de fluorescência para detectar danos à célula hospedeira.

Protocolo

1. Microscopia - Preparação da pastilha de ágar

1. Prepare as almofadas de ágar cerca de 30 minutos a 1 hora antes das amebas estarem prontas para serem misturadas com Pseudomonas aeruginosa.
2. Micro-ondas 50 mL de ágar de 1% (p/v) em tampão de desenvolvimento (DB) em um frasco de 250 mL. Misture a cada 20 segundos até que os tufos de ágar desapareçam.
3. Resfrie o ágar derretido colocando-o em um banho-maria pré-aquecido a 55 °C por 15 minutos.
4. Adicione 15 μL da solução de calceína-AM em 15 mL do ágar fundido em um tubo cônico. Misture invertendo suavemente o tubo 4 a 5 vezes e proceda imediatamente para a próxima etapa.
   NOTA: Reali....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
Bacto ágar, desidratado	BD Difco	214010
Antibiótico-Antimicoótico (100X)	Tecnologias de Vida	15240062	A alíquota < 1 mL e armazenada a -20 °C
Éster de calceína-acetoximetil (calceína-AM)	Tecnologias de Vida	C34852	Calceína Acetoximetil (AM)
Cloreto de cálcio, anidro	Sigma-Aldrich	C1016
D-Glicose	Fisher Chemical	D16500	Dextrose
Dimetil sulfóxido	Sigma-Aldrich	D5879
Ácido fólico	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	M8266
Extrato de levedura	Oxoide	LP0021
Peptone especial	Oxoide	LP0072
Hiróxido de potássio	Fisher Chemical	P250
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	P0662
Fosfato de sódio dibásico heptahidratado	Fisher Chemical	S373
Vitamina B12	Sigma-Aldrich	V2876
Cepas
Discoideum de dictyostelium	Laboratório Siryaporn	Strain AX318
Escherichia coli	Laboratório Siryaporn	Cepa B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Laboratório Siryaporn	PA14	Cepa PA14
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Laboratório Siryaporn	AFS20.1	Cepa 20 derivada do PA14
Suprimentos
Filtro de 0,22 μm	Millipore	SCGPT01RE	Para esterilização com filtro
Tubo cônico, 15 mL	Corning	352097
Garrafas de vidro para armazenamento	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Placa de Petri, 6 cm de diâmetro	Corning	351007	Placas de poliestireno de 60 x 15 mm
Placa de Petri, 10 cm de diâmetro	Fisher	FB0875712	Placas de poliestireno de 100 x 15 mm
Recipientes plásticos com tampa	Ziploc	2.57E+09	Recipientes quadrados de 3 xícaras
Placas de vidro	Bio-Rad	1653308	Para preparar almofadas de ágar. Outras placas de vidro podem ser usadas com dimensões semelhantes.
Bastões de madeira	Fisher	23-400-102
Equipamento
Microscópio Eclipse Ti-E	Nikon	MEA53100	Configuração do microscópio
10X Plan Fluor Ph1 objetivo 0,3 NA	Nikon	MRH20101	Configuração do microscópio
Fonte de excitação por fluorescência	Lumencor	Motor leve Sola	Configuração do microscópio
Conjunto de filtros de fluorescência	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Configuração do microscópio
Câmera Orca Flash 4.0 V2	Hamamatsu	77054098	Configuração do microscópio
ImageJ	NIH	v. 1.49	Software para análise de imagens
MATLAB	Mathworks	R2013	Software para análise de imagens
Incubadora de shaker orbital	VWR	89032-092	Para crescimento de bactérias a 37 °C
Agitador de plataforma	Fisher	13-687-700	Para crescimento de amebas a 22 °C
Espectrofotômetro	Biochrom	Ultrospec 10
Incubadora refrigerada sob o balcão	Fisher	97990E	Para crescimento de amebas a 22 °C
Banho-maria isotemp	Fisher	15-462-21Q	Para meio de resfriamento a 55 °C