Avaliação da Carga Bacteriana no Baço de Camundongos para Estudos de Infecção

Resumo

Fonte: Madenspacher, J. H. e Fessler, M. B. Um método não invasivo e tecnicamente não intensivo para indução e fenotipagem de pneumonia bacteriana experimental em camundongos. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o processo de quantificar a carga bacteriana no baço de um camundongo infectado para avaliar a gravidade da infecção. O baço homogeneizado é diluído em série e placado para determinar a carga bacteriana total. Os dados resultantes fornecem insights sobre as interações hospedeiro-patógeno dentro do tecido sistêmico.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.

1. Aspiração intratraqueal murina de Klebsiella pneumoniae da orofaringe

1. Certifique-se de que os camundongos sejam identificados de forma única por marca de cauda, tatuagem ou outro identificador aprovado.
2. Elabore um inóculo dosístico das bactérias usando uma pipeta P200 antes de remover camundongos do isoflurano para agilizar o procedimento. Para melhores resultados com aspiração de i.t., use um volume de <100 μl para evitar transbordamento. Aqui, utilize 2000 unidades formadoras de colônias (CFU)/50 μl de K. pneumoniae.
3. Anestesiar camundongos em uma câmara transparente com gás isoflurano (por exemplo, 2% de isoflurano com vazão de 1 L/min) ou conforme as diretrizes institucionais. O número de camundongos a anestesiar juntos é determinado pelo nível de conforto do experimentador, tipicamente 1 a 2 por vez. Observe a respiração e confirme o nível de anestesia assim que as respirações profundas forem visíveis, e 2-3 segundos podem ser contados entre as respirações. NOTA: Se houver preocupação sobre possíveis efeitos de confusão dos anestésicos voláteis (inaláticos), a anestesia pode ser alcançada com injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina. Com o método descrito acima, a anestesia profunda dura apenas alguns minutos. Se for induzida uma anestesia prolongada, deve ser usada pomada ocular para evitar a dessecação ocular.
4. Uma vez anestesiado, posicione-o em posição semi-reclinada deitada, suspenso pelos incisivos maxilares de um elástico esticado entre pinos em uma tábua inclinada de Plexiglas (Figura 1).
5. Puxe suavemente a língua do rato para o lado com um par de pinças sem costas e deposite a dose na cavidade oral com uma pipeta P200. Tenha muito cuidado para evitar causar traumas na língua ou na orofaringe.
6. Enquanto mantém a língua retraída, oclua suavemente o nariz com um dedo enluvado até que o rato inspire. Continue cobrindo o nariz até que o camundongo tenha feito duas ou mais inalações, e nenhum líquido seja visível na cavidade oral. Cobrir o nariz ajuda a garantir que o camundongo inale as bactérias para os pulmões, já que os camundongos são respiradores nasalis obrigatórios.
7. Retire o camundongo da placa de inoculação e volte para sua gaiola, colocando-o de costas para evitar que cama ou detritos bloqueiem as narinas enquanto ele se recupera da anestesia.
8. Depois que todos os camundongos foram dosados e acordaram da anestesia, camundongos domésticos em um cubículo/sala contendo apenas ratos que foram dosados com K. pneumoniae. Monitore os camundongos diariamente, incluindo o peso corporal, se passar de 48 horas após a infecção.
9. Use mosturação diária e/ou calor suplementar se permitir que os ratos ultrapassem 48 horas.

2. Determinação da Carga Bacteriana nos Tecidos Pulmonares e Periféricos

1. Antes de começar: prepare tubos de diluição com 900 μl de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) para pulmão e baço e 90 μl de 1x PBS para sangue. Placas de etiqueta para cultivo de bactérias e fixadas em temperatura ambiente; portanto, uma vez coletado o tecido, o tempo será minimizado entre a homogeneização e a formação para o crescimento bacteriano.
   NOTA: Devido à deposição heterogênea de bactérias nos pulmões que pode ocorrer com aspiração, recomenda-se que camundongos individuais sejam usados para análise da celularidade total das vias aéreas ou da carga bacteriana total (bilateral) pulmonar.
2. Eutanasie camundongos conforme as diretrizes institucionais. Aqui, utilize uma injeção letal de 150 mg/kg de pentobarbital sódico ou uma dose equivalente de solução comercial para eutanásia, seguida de exsanguinação, pois isso evita possíveis complicações pulmonares associadas à inalação de CO₂ e à luxação cervical.
3. Remova o baço e coloque em 2 ml de 1x PBS. Coloque tubos no gelo. Tenha cuidado para limpar os instrumentos com etanol entre cada tecido/mouse.
4. Homogeneize o tecido no gelo, preferencialmente com homogeneizadores descartáveis que podem ser trocados entre cada amostra. Ponteiras homogeneizadoras descartáveis podem ser autoclavadas para reutilização entre experimentos.
5. Uma vez homogeneizado o tecido, realize diluições seriadas e placa. Amostras em placa de um determinado tecido/diluição em duplicidade em uma única placa de ágar de soja tríptico (TSA) desenhando uma linha divisória no plástico. As sugestões de placagem e diluição são mostradas abaixo (em todos os casos, 10 μl de amostra são espalhados na placa) e baseiam-se em uma necrópsia de 24 horas após a infecção. Ao analisar amostras de 48 a 72 horas, pode ser necessário colocar um número maior de diluições devido ao aumento da carga bacteriana em momentos posteriores
   1. Para baço - dilua 1:10-1:100 adicionando 100 μl de baço homogeneizado a 900 μl de PBS estéril 1x em série. Placas homogenizadas e ambas diluídas em duplicado.
6. Deixe as amostras espalhadas secarem brevemente.
7. Inverta as placas TSA e coloque em uma incubadora estática a 37 °C durante a noite.
8. Determine o número de bactérias colonizadoras fazendo a média das colônias bacterianas de ambos os lados da placa e de cada diluição. Considere as diluições iniciais de 5 ml para o pulmão e 2 ml para o baço para determinar o total de CFUs de tecido.

Resultados

Figura 1: Conselho de Procedimentos para Pneumonia por Aspiração em Camundongos. Os camundongos de estudo são posicionados, cabeça para cima e de costas para a tábua (ou seja, semi-reclinados), suspensos pelos incisivos em um elá...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ATCC	43816
Becton Dickenson	211825
Preparado internamente	N/A	Água destilada (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na₂HPO₄ (5,75 g), KH₂PO₄ (1 g)