Visualização de Metabólitos de Aminoácidos em Tecidos Intestinais de Ratos Infectados

Resumo

Fonte: Specker, J. T., et al. Investigação da cooperação microbiana por meio de análise por espectrometria de massa por imagem de colônias bacterianas cultivadas em ágar e tecido durante infecções. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o uso da espectrometria de massa de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) para visualizar a distribuição de aminoácidos em tecidos intestinais de camundongos infectados com Clostridioides difficile, sozinho ou em combinação com Enterococcus faecalis. O procedimento envolve preparação de tecidos, aplicação de matriz, ionização a laser e detecção de íons aminoácidos para gerar imagens espaciais de íons. Os resultados revelam cooperação microbiana, já que E. faecalis altera o ambiente intestinal ao liberar ornitina e esgotar a arginina, aumentando assim a patogênese de C. difficile .

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.

1. Preparação e envio de tecidos cecais de camundongos de controle não infectados e de C. difficile
   1. Inocule camundongos machos de 4 a 8 semanas com C57BL/6 machos com antibióticos (0,5 mg/mL cefoperazona ou 0,5 mg/mL cefoperazona + 1 mg/mL vancomicina) em água potável ad libitum por 5 dias, seguido por um período de recuperação de 2 dias e infecção subsequente.
   2. Eutanasie os animais por asfixia de CO₂ e colhe imediatamente o órgão do ceco do camundongo. Insome em uma mistura de 20% de composto de temperatura de corte ideal (OCT) em água destilada.
   3. Coloque as amostras em gelo seco e depois embale e envie para análise; armazene a -80 °C até a análise.

 

2. Criossecção de controle não infectado versus tecidos cecais de camundongos infectados por C. difficile

1. Limpe todos os equipamentos de criossecção enxaguando com etanol 100% e deixe secar antes de colocar as amostras na câmara do criosto. Prepare lâminas de microscópio revestidas com ITO usando um ohmímetro para identificar o lado da lâmina com o revestimento condutor. Use uma gravadora com ponta diamantada para gravar e rotular o lado revestido com ITO da lâmina do microscópio.
   NOTA: Equipamentos adequados de proteção individual, incluindo luvas, óculos de laboratório, jaleco e mangas crióstaticas, devem ser usados.
2. Realize criossecção em um criomrotônio de pesquisa. Transfira os tecidos de ceca de camundongos embutidos com OCT de um freezer a -80 °C para a câmara criomicrótomo (temperatura de câmara de 30 °C, temperatura de objeto de -28 °C) sobre gelo seco. Monte as amostras de tecido a serem comparadas usando espectrometria de massa por imagem (por exemplo, controle não infectado vs. infectado por C. difficile) na mesma lâmina do microscópio para garantir a preparação idêntica da amostra de ambos os tipos de tecido e permitir comparações precisas de metabólitos.
3. Dentro da câmara do criomicrotômo, monte o tecido embutido com OCT em um mandril de amostra usando uma solução adicional de OCT. Depois que a solução OCT solidificar, fixe o mandril na cabeça da amostra. Comece a criosseção em incrementos de 10 a 50 μm para alcançar a profundidade/plano desejado do órgão.
4. Uma vez atingida a seção transversal ideal do tecido, comece a coletar seções com espessura de 12 μm. Manuseie a fatia suavemente usando pincéis de artista e coloque-a sobre uma lâmina de microscópio revestida com Teflon.
5. Role a lâmina de microscópio revestida com ITO sobre a seção de tecido para pegar o tecido da lâmina revestida com Teflon. Descongele a seção de tecido na lâmina do microscópio pressionando a palma da mão na parte de trás da lâmina revestida com ITO. Continue descongelando a montagem até que a seção de tecido passe de translúcida para uma textura opaca/fosca.
6. Transfira as lâminas de microscópio montadas em tecido sobre gelo seco para uma caixa seca com dessecante para armazenamento para análise no mesmo dia, ou armazene a -80 °C para armazenamento a longo prazo.

3. Preparação de tecidos cecais de camundongos de camundongos não infectados por C. difficile para aplicação em matriz e espectrometria de massa de imagem MALDI

1. Realize a aplicação da matriz MALDI (temperatura do bico de 30 °C, oito passagens, vazão de 0,1 mL/min, padrão CC, tempo de secagem de 0 s, 10 psi).
2. Realizar espectrometria de massa de imagem MALDI
3. Analise as imagens de íons de múltiplas réplicas biológicas e compare os resultados para significância por meio de comparações de diagramas de intensidade usando o software estatístico SCiLS referenciado acima.
   NOTA: Os testes estatísticos e comparações apropriados dependerão da aplicação e podem incluir segmentação espacial, modelos de classificação e análise comparativa para determinar características espectrais discriminativas e correlacionadas. Análises comparativas podem incluir a atribuição de valores p a características significativas, geração de análises de componentes principais para comparações de tecidos e visualização de gráficos de caixa para identificar variações. Também é útil visualizar o tecido usando microscopia de campo claro da seção de tecido corada por hematoxilina e eosina (H&E) após espectrometria de massa por imagem. Isso permite a identificação clara das características morfológicas no tecido e pode ser analisado em consulta com um patologista treinado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtros de seringa de nylon Titan3 de 0,2 μm	Termo Científica	42225-NN
Matriz MALDI 1,5-diaminonaftaleno	Sigma Aldrich	2243-62-1
Seringas Henke Ject luer lock de 20 mL	Henke Sass Wolf	4200.000V0
Medidor de vácuo por convecção da série 275i	Empresa Kurt J. Lesker	KJL275807LL
Espectrômetro de massa 7T solariX FTICR equipado com um sistema de laser Smartbeam II Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm)	Bruker Daltonics
Solução de ácido acético, adequada para HPLC	Sigma Aldrich	64-19-7
Acetonitrila, adequada para HPLC, grau gradiente, ≥99,9%	Sigma Aldrich	75-05-8
Solução de hidróxido de amônia, 28% de NH3 em H2O, ≥99,99% base de metais-traço	Sigma Aldrich	1336-21-6
Bolsas de risco bio-autoclavável: 55 galões	Grainger	45TV10
Sacolas de transporte de espasmes de risco biológico (8 x 8 pol.)	Fisher Scientific	01-800-07
Caldo de infusão cerebral	BD em Biociências	90003-040
C57BL/6 camundongos machos	Laboratórios Jackson
Scanner fotográfico e de documentos CanoScan 9000F Mark II	Canon
CM 3050S criomrotô de pesquisa	Leica Biosystems
Gabinete dessecador	Sigma Aldrich	Z268135
Gravador de pontas de diamante, Ciências da Microscopia Eletrônica	Fisher Scientific	50-254-51
Pellets dessecantes de drierita	Drierita	21005
Etanol, 200 Proof	Laboratórios de Descontaminação	2701
Software flexImaging	Bruker Daltonics
software ftmsControl	Bruker Daltonics
Armadilha de vácuo de vidro	Sigma Aldrich	Z549460
Pulverizador robótico HTX M5 TM	Tecnologias HTX
Lâminas de microscópio revestidas com óxido de índio e estanho (ITO)	Delta Technologies	CG-81IN-S115
Filtro HEPA em linha para bomba de vácuo	LABCONCO	7386500
Metanol, Grau HPLC	Fisher Chemical	67-56-1
Adaptador deslizante MTP II	Bruker Daltonics	235380
Composto de temperatura de corte ideal (OCT)	Fischer Scientific	23-730-571
Esporicida, Desinfetante e Limpador de Utriz Peridox	CONTEC	CR85335
Laminais impressas em PTFE (Teflon), Electron Microscopy Sciences	VWR	100488-874
Bomba de vácuo de palhetas rotativas RV8	Edwards	A65401903
Lâminas descartáveis de microtomo Tissue-Tek Accu-Edge de alto perfil	Ciências da Microscopia Eletrônica	63068-HP
Tubo de vácuo transparente	Cole Palmer	EW-06414-30
Óleo de bomba de vácuo Ultragrade 19	Edwards	H11025011
Transformador de tensão variável	Powerstat
Água, adequada para HPLC	Sigma Aldrich	7732-18-5
Frasco dewar de boca larga	Sigma Aldrich	Z120790