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1. Avaliação do Efeito de Inibidores de Pequenas Moléculas na Formação de Filmes e Colônias de Biofilmes
- Prepare uma solução 2x de meio definido de MSgg (glutamato-glicerol monossódico) indutor de biofilme, sem cloreto de cálcio e cloreto de ferro(III) hexahidratado. Após a esterilização do filtro, adicione o cloreto de cálcio. O meio está pronto para uso diretamente, ou pode ser armazenado a 4 °C no escuro.
- Prepare a diluição 1x MSgg no dia do experimento.
- Dilua o meio 2x MSgg em 1x com água destilada estéril (películas) ou ágar estéril a 3% quente (80 °C) (biofilmes) e adicione cloreto de ferro(III) hexahidratado a uma concentração final de 50 μM (películas) ou 250 μM (biofilmes). Adicione antibióticos ou inibidores de pequenas moléculas à concentração desejada e misture bem. Por exemplo, para obter uma concentração final de 0,5 mM de D-leucina em 30 ml para estabelecer filmes ou biofilmes, adicione 196,6 μl de uma solução de estoque de D-leucina de 76,3 mM (10 mg/ml).
NOTA: A composição final 1x do MSgg é descrita na Tabela 1. Comparado à receita original, o meio continha 50 μg/ml de treonina, e a concentração de ferro para cultivar colônias de biofilme em meio sólido MSgg foi aumentada 2,5 vezes para otimizar a morfologia das colônias enrugadas.
- Após a solidificação do ágar, seque as placas sólidas de MSgg em um capuz biológico por 30 a 45 minutos antes da inoculação.
- Para selecionar inibidores específicos que interferem nos mecanismos de formação das películas (Figura 1), descarte que as concentrações utilizadas afetem o crescimento planctônico e estático.
- Determine o crescimento planctônico (aumento da densidade óptica ao longo do tempo em cultura líquida) em uma curva de crescimento simples medindo a densidade óptica a 600 nm a cada hora até a fase de crescimento estacionário.
- Para confirmar que a turbidez medida da cultura representa a contagem de células vivas, determine o número de unidades formadoras de colônias (CFU) de células na fase de crescimento planctônico a partir de uma cultura agitada em vários pontos de tempo.
- Para avaliar o efeito de inibidores de pequenas moléculas no crescimento estático da película, colhe células ao final de uma incubação de 3 dias a 23 °C de um poço de cultivo celular de 24 poços, inoculado sob as mesmas condições descritas nas seções 1.7-1.9, e determine a UFC. Para esse controle, use uma deformação deficiente em película que não possua os operons que codificam os componentes da matriz extracelular (ou seja, B. subtilis ΔepsH, ΔtasA).
NOTA: Essa cepa é capaz de crescer sob condições estáticas, mas, ao contrário do tipo selvagem formador de películas, ela é deficiente na capacidade de flutuar até a interface líquido-ar, onde o crescimento é favorecido devido ao aumento dos níveis de oxigênio. Assim, essa cepa extracelular deficiente em matriz e película é uma cepa de referência recomendada para avaliar o crescimento sob condições estáticas.
NOTA: Para o exemplo específico do aminoácido D não canônico D-leucina descrito abaixo, foi descartado um efeito sobre o crescimento planctônico e estático em concentrações que interferissem na formação da película. Os métodos para determinar o crescimento planctônico e estático são descritos em detalhes.
- Retire B. subtilis de um estoque de -80 °C (cultura LB de 109 células/ml congeladas em 20% de glicerol) para isolar colônias individuais em uma placa de ágar LB-1,5% com uma ponta estéril ou bastão aplicador.
- Cultive durante a noite a 30 °C.
- PASSO CRÍTICO: Para uma inibição robusta da película pelos aminoácidos D não canônicos, como a D-leucina, cultive uma única colônia colhida da placa de ágar LB-1,5% em 3 ml de caldo LB a 37 °C por 4 horas em uma incubadora agitada (velocidade de agitação 200 rpm). Substitua o caldo LB por meio MSgg indutor de biofilme antes da inoculação, centrifugando 1,5 ml de cultura inicial por 4 min a 6.000 x g, removendo cuidadosamente o sobrenadante e ressuspendendo o pellet em 1,5 ml de meio MSgg. O restante da cultura pode ser descartado. Importante: Para garantir a robustez do sistema, a densidade óptica a 600 nm (OD600) da cultura de arranque lavada deve estar entre 0,6 e 1.
- Durante o crescimento da cultura starter, prepare uma placa multiplacas de cultura celular de 12 poços contendo 3 ml de meio MSgg sem ou com uma faixa de concentração do inibidor de moléculas pequenas (por exemplo, 0,3, 0,5, 1 mM de D-leucina). Para descartar efeitos de borda, distribua a localização das diferentes concentrações ao longo da placa multiplaca. Alternativamente, utilize placas multidish de cultura celular de 24 poços contendo 1,5 ml de meio MSgg.
- Inocule os poços da placa multiprato de cultura celular de 12 poços com 3 μl da cultura inicial lavada (diluição 1:1.000).
NOTA: Uma razão de diluição menor, ou seja, 1:500, pode ser utilizada. Isso diminui o tempo de desenvolvimento das películas. - Cultive as películas a 23 °C em condições estáticas por três dias. Não mova as películas durante esse tempo, pois isso pode afetar a morfologia final da superfície da película.
- Tire fotos com binóculos e exposição homogênea de relâmpagos. Alternativamente, tire uma foto das películas com uma câmera de alta resolução. Para evitar artefatos causados por ângulos de luz e sombras inconsistentes, tire fotos de cima para baixo com a câmera fixada em um tripé e use uma fonte de luz macia e grande a 45° de ambos os lados.
NOTA: Um método alternativo para estudar a multicelularidade de B. subtilis é o ensaio de colônia de biofilmes em meio sólido e indutor de biofilmes MSgg. Assim como as películas, esse ensaio permite o estudo dos processos espaço-temporais. Uma vez determinada a faixa ativa dos inibidores de pequenas moléculas, seu efeito na formação de colônias de biofilmes pode ser estudado. - Para cultivar colônias de biofilme, ponha simetricamente 1,5 μl da pré-cultura não lavada (Passo 1.7) na placa de ágar 1,5% MSgg seca com a ajuda de um molde — 4 gotas por placa de Petri de 8,5 cm de diâmetro. Deixe as gotas absorverem para a placa antes de movê-las.
NOTA: O molde ajuda a obter uma distribuição igual das colônias de biofilme na área onde as células são cultivadas. Para preparar o modelo, desenhe a área total de crescimento nas escalas originais, divida-a em setores iguais e marque o centro. Para uma placa de Petri redonda de 8,5 cm de diâmetro, isso atribui 14 cm2 a uma colônia de biofilme. - Incube as placas a 30 °C por três dias. Durante esse período, as colônias de biofilme se desenvolvem e formam uma estrutura tridimensional e enrugada.
- Tire fotos como no passo 1.11.
Tabela 1. Composição final de 1x MSgg usada neste estudo.
| 1,925 mM | Fosfato de potássio monobásico |
| 3,075 mM | Dibásico fosfato de potássio |
| 100 mM | ácido 3-(N-morfolino)propanosulfônico, pH 7,1 |
| 2 mM | Cloreto de magnésio hexahidratado |
| 700 μM | Cloreto de cálcio anidro |
| 50 μMa | Cloreto de ferro(III) hexahidratado |
| 125 μMb |
| 1 μM | Cloreto de zinco anidro |
| 2 μM | Cloridrato de tiamina |
| 50 μg/ml | Triptofano |
| 50 μg/ml | Fenilalanina |
| 50 μg/ml | Treonina |
| 0,5% (v/v) | Glicerol anidro |
| 0,5% (v/v) | Ácido L-glutâmico sal monossódico hidrato |
| Apara ensaio de película; bpara ensaio de biofilme |
