Ensaio de Resistência ao Etanol para Avaliar a Integridade da Matriz de Biofilme

Resumo

Fonte: Bucher, T., et al. Metodologias para Estudo de Biofilmes de B. subtilis como modelo para caracterização de inibidores de biofilmes de pequenas moléculas. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra como a integridade da matriz de biofilmes influencia a resistência bacteriana ao etanol, comparando unidades formadoras de colônias em biofilmes não tratados e com inibidores interrompidos. A redução das UFCs em amostras tratadas com inibidores demonstra que a matriz extracelular é essencial para proteger as células embutidas em biofilme contra o estresse antimicrobiano.

Protocolo

1. Ensaio de Resistência ao Etanol

1. Cultive biofilmes e, após 68 horas de crescimento a 30 °C, corte as colônias de biofilme em duas partes iguais com a ajuda de uma lâmina de barbear e o mole.
2. Levante cuidadosamente cada metade da colônia de biofilme da placa de ágar com uma pequena espátula e mova-a para um tubo microcentrífuga de 1,5 ml contendo 500 μl de soro salino tamponado com fosfato (PBS). Se necessário, raspe as células restantes da placa e transfira-as também para o tubo da microcentrífuga.
   NOTA: A segunda metade da colônia de biofilme é tratada de forma diferenciada, dependendo se é o controle ou para testar a resistência a agentes esterilizantes.
3. Para o controle, incube a segunda metade da colônia de biofilme em 500 μl PBS. Para avaliar a resistência a agentes esterilizantes, transfira a segunda metade da colônia de biofilme para 500 μl de etanol com 50% (v/v).
   NOTA: Agentes esterilizantes alternativos, como hipoclorito de sódio, podem ser utilizados. Para todos os agentes esterilizantes utilizados, determine a concentração ativa e o tempo de incubação em um experimento preliminar.
4. Incube as colônias de biofilme por 10 minutos na bancada em temperatura ambiente.
5. Centrifuge as colônias de biofilme por 5 minutos a 18.000 x g e remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta. Adicione 300 μl de PBS.
6. Sonice as células levemente (amplitude 10%, pulso 5 segundos) com a microponta de um sonicador.
   NOTA: A energia de sonicação deve ser suficiente para separar os agregados de biofilme. No entanto, uma sonicação muito agressiva pode lisar as células. Confirme antecipadamente por microscopia óptica que a energia de sonicação usada não lisa as células e que todos os agregados estão dissolvidos.
7. Adicione 700 μl de PBS a um volume final de 1 ml. Realize uma diluição serial (até ^10-7) em PBS e espalhe 100 μl de 3 diluições em uma placa de ágar LB-1,5% usando esferas de vidro estéreis.
   NOTA: As diluições ideais a serem placadas devem ser determinadas em um experimento preliminar, pois isso depende da quantidade de células na colônia de biofilme de interesse e da taxa de sobrevivência das células em resposta ao agente esterilizante.
8. Incube as placas durante a noite a 30 °C, conte a UFC e determine a UFC/ml. A partir da CFU/ml final de cada uma das colônias de biofilme metade, calcule a porcentagem de sobreviventes.
   NOTA: Quando realizados e analisados conforme descrito, as duas metades da colônia de biofilme controle e a metade não tratada versus tratada com etanol da colônia de biofilme não tratada devem apresentar diferenças abaixo de 10% na contagem celular viável, verificando a simetria ou a resistência da colônia, respectivamente. Alternativamente, os resultados podem ser representados em CFU total. A contagem celular da colônia de biofilme controle e não tratada deve permanecer na mesma ordem de grandeza. Em contraste, espera-se que a contagem celular da metade tratada com etanol de uma colônia de biofilme tratada com molécula pequena caia no mínimo duas ordens de magnitude para alegar um aumento da sensibilidade ao agente esterilizante.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Luria Broth, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
Fosfato de potássio monobásico	Sigma, 136,09 g/mol	P0662-500G
Dibásico fosfato de potássio	Fisher Scientific, 174,18 g/mol	BP363-1
Ácido 3-(N-morfolino)propanosulfônico	Fisher Scientific, 209,27 g/mol	BP308-500
Cloreto de magnésio hexahidratado	Merck, 203,30 g/mol	1.05833.0250
Cloreto de cálcio anidro	J.T. Baker, 110,98 g/mol	1311-01
Manganês(II) cloreto tetrahidrato	Sigma, 197,91 g/mol	31422-250G-R
Cloreto de ferro(III) hexahidratado	Sigma, 270,30 g/mês)	F2877-500G
Cloreto de zinco anidro	Acros Organics, 136,29 g/mol	424592500
Cloridrato de tiamina	Sigma, 337,27 g/mol	T1270-100G
L-triptofano	Fisher Scientific, 204,1 g/mol	BP395-100
L-fenilalanina	Sigma, 165,19 g/mol	P5482-100G
L-treonina	Sigma, 119,12 g/mol	T8625-100G
Glicerol anidro	Bio-Lab Itd	712022300
Os sais monossódicos do ácido L-glutâmico hidratam	Sigma, 169,11 g/mol	G1626-1KG
D-leucina	Sigma, 169,11 g/mol	855448-10G
Etanol anidro	Gadot	830000054
Lâmina de barbear	Eddison	NA
Papéis filtrantes circulares de celulose	Whatman, 90 mm	1001-090
Glutaraldeído	EMS (Ciência da Microscopia Eletrônica), 25% em água	16220
Paraformaldeído	EMS, 16% em água	15710
Cacodilato de sódio	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
Cloreto de cálcio 2-hidratado	Merck, 147,02 g/mol	1172113
Shaker 37 °C	Innowa Científica de New Brunswick	NA
Centrífuga	Centrífuga de mesa Eppendorf 5424	NA
Sonificador Digital, Modelo 250, usado com Double Step Microtip	Branson	NA
Incubadora 30 °C	Fichário	NA
Incubadora 23 °C	Fichário	NA
Sistema de Filtro, 500 ml, poliestireno	Cornig Incorporated	NA
Agitador rotativo - Orbitron Rotatory II	Boekel	NA