Preparação de Colônias de Biofilmes Bacterianos para Análise Morfológica

Resumo

Fonte: Bucher, T., et. al., Metodologias para Estudo de Biofilmes de B. subtilis como Modelo para Caracterização de Inibidores de Biofilmes de Pequenas Moléculas. J. Vis. Exp.(2016)

Este vídeo demonstra a preparação de colônias maduras de biofilme bacteriano para imagens de alta resolução. Ele cobre etapas de fixação, desidratação, montagem e revestimento metálico para preservar e visualizar a morfologia do biofilme.

Protocolo

Preparação de Amostra de Colônia de Biofilme para Microscopia Eletrônica de Varredura

1. Cultive colônias de biofilme bacteriano.
2. Prepare um novo lote de glutaraldeído a 2% (v/v), solução de paraformaldeído a 3% (v/v) em 100 mM de cacodilato de sódio, 5 mM de tampão de cloreto de cálcio, pH 7,3. Prepare 5 ml de fixador para cada placa de Petri de 8,5 cm de diâmetro.
   ATENÇÃO: Glutaraldeído e paraformaldeído são perigosos. Manusei-os com equipamentos de segurança dentro de um capuz químico. Descarte as soluções e os materiais contaminados nos resíduos perigosos.
3. Adicione cuidadosamente o fixador às colônias de biofilme, sem dispensar diretamente sobre os biofilmes.
   NOTA: Devido ao caráter hidrofóbico da colônia de biofilme, as colônias se desprendem lentamente do ágar e começam a flutuar.
4. Sele cuidadosamente as placas com uma tira de Parafilm. Incube em um shaker rotativo por 2 horas em temperatura ambiente e, em seguida, transfira as placas para 4 °C durante a noite.
5. No dia seguinte, remova cuidadosamente o líquido com uma pipeta Pasteur conectada a uma bomba de vácuo.
6. Adicione cuidadosamente 10 ml de cacodinato de sódio, 5 mM de buffer de cloreto de cálcio para lavar o biofilme e incubar por 5 min. Remova suavemente o líquido com a pipeta de vidro Pasteur do canto da placa para evitar danificar o biofilme, e adicione uma solução de lavagem fresca pipetando suavemente. Repita essa etapa uma vez.
7. Para a desidratação das colônias de biofilme, prossiga com os seguintes passos: 2x 5 min em_{ddH 2}O; 2x 20 min em 30% etanol; 2x 20 min em 50% etanol; 2x 20 min em 70% etanol; 2x 20 min em etanol 96%; 2x 30 min em 100% etanol.
   1. Adicione 15 ml de líquido para cada placa de Petri de 8,5 cm de diâmetro em cada etapa e retire o líquido cuidadosamente após cada incubação.
8. Use um de dois métodos diferentes para secar as amostras do etanol.
   1. Para secagem ao ar a partir de etanol:
      1. Corte um papel filtro de celulose (diâmetro de 9 cm) em quartos. Submerga brevemente um quarto em 100% etanol e depois transfira cuidadosamente uma colônia flutuante de biofilme para ele. Coloque o papel de filtro úmido em uma placa de Petri forrada com papel filtrante. Cubra a placa de Petri e deixe as colônias de biofilme secarem durante a noite em um capuz químico.
9. Cubra um pedaço de microscopia eletrônica com fita de carbono. Com a ajuda de uma pinça, transfira cuidadosamente as colônias de biofilme para o toco. Conecte cada colônia ao stub adicionando uma ponte fina de fita de carbono, que é crucial para a eliminação de carga sob o feixe de elétrons. Nessa fase, manuseie as colônias de biofilme com cuidado, pois elas são muito frágeis. Armazene as amostras em um dessecador por pelo menos 24 horas ou até a análise.
10. No dia do exame, com o microscópio eletrônico de varredura (SEM), revestir as colônias de biofilme por 2 minutos em um ângulo de 60° em um sputter-coater de ouro e paládio. Repita essa etapa duas vezes e gire as amostras 120° entre elas. No final, passe uma camada de spray nas amostras por 3 minutos a partir do topo. A camada fina de 20 nm de paládio de ouro melhora a condutividade e realça o contraste da amostra para a imagem em microscopia eletrônica de varredura.
11. Armazene as amostras em um dessecador para evitar a reidratação da amostra até a imagem com um microscópio eletrônico de varredura.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Glicerol anidro	Bio-Lab Itd	712022300
Etanol anidro	Gadot	830000054
Lâmina de barbear	Eddison	NA
Papéis filtrantes circulares de celulose	Whatman, 90 mm	1001-090
Glutaraldeído	EMS (Ciência da Microscopia Eletrônica), 25% em água	16220
Paraformaldeído	EMS, 16% em água	15710
Cacodilato de sódio	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
Cloreto de cálcio 2-hidratado	Merck, 147,02 g/mol	1172113
Montagem de alumínio	EMS, cabeça ranhurada	75230
Fita adesiva de carbono	EMS	77825-12
Shaker 37 °C	Innowa Científica de New Brunswick	NA
Incubadora 30 °C	Fichário	NA
Incubadora 23 °C	Fichário	NA
Agitador rotativo - Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
Revestimento Sputter S150	Edwards	NA
Microscópio Eletrônico de Varredura Ambiental	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA