Um método de coverglass com câmara para formação in vitro de biofilmes bacterianos

Resumo

Fonte: Beaudoin, T., et al. Visualizando os efeitos do escarro no desenvolvimento de biofilme usando um modelo de vidro coberto com câmara. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o uso de um coverglass com câmara para estudar o efeito dos fatores do hospedeiro do escarro derivados do paciente com fibrose cística no desenvolvimento de biofilme bacteriano.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Método do Coverglass Chambered Coverglass para Formação de Biofilme
   1. Cultive isolado bacteriano de interesse durante a noite no meio desejado a 37 °C com agitação (200 rpm).
      NOTA: Diversas bactérias foram usadas, incluindo isolados clínicos Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, complexo Burkholderia cepacia e Achromobacter xylosoxidans. A escolha do meio depende das cepas e condições de interesse, porém (caldo Luria) mídia LB pode ser usada para experimentos iniciais.
   2. A partir da cultura durante a noite, coloque 40 μl de cultura em 4 ml de meio fresco e cultive por 3-4 horas a 37 °C com agitação (200 RPM) para obter uma cultura com densidade óptica de 600 nm (OD600) de aproximadamente 0,5-0,6.
   3. Dilua a cultura do passo 1.2 até 1/5 no meio desejado com filtrado de escarro a 10% ou sem filtrado de escarro (como controle). Outras concentrações de filtrado de escarro podem ser testadas (ou seja, 50% ou 100%).
   4. Use 200 μl da diluição para semear poços de câmaras de lâminas.
   5. Deixe as bactérias se unirem por 4 horas a 37 °C sem sacudir.
   6. Após 4 horas, remova o substrato e lave suavemente o biofilme com 1x novo substrato. Substitua por meio fresco de 200 μl.
      NOTA: Para estudar os efeitos do escarro no biofilme, o meio fresco deve conter supernadante do escarro.
   7. Deixe os biofilmes crescerem pelo tempo desejado a 37 °C sem agitação, substituindo o substrato a cada 12 horas, sem lavar até o momento da microscopia.
      NOTA: Para estudar o efeito dos supernadantes do escarro na suscetibilidade a biofilmes, antibióticos são adicionados ao meio após 24 horas de crescimento do biofilme e mantidos no meio até a coloração e imagem dos biofilmes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lab-Tek II Vidro coberto com câmara, borosilicato #1.5, 8 poços	Thermo Sicher Scientific	155409
Millers LB Roth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Mídia padrão para crescimento overnight/crescimento de biofilme