Imagem Confocal de Biofilmes Bacterianos Induzidos por Filtrados de Escarro em Pacientes com Fibrose Cística

Resumo

Fonte: Beaudoin, T., et al. Visualizando os efeitos do escarro no desenvolvimento de biofilme usando um modelo de vidro coberto com câmara. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra um método in vitro para avaliar como a fibrose cística derivada do paciente influencia a formação de biofilmes bacterianos. Utilizando lâminas de câmara, coloração fluorescente e microscopia confocal, revela espessura aumentada, arquitetura alterada e maior biomassa viável em biofilmes cultivados com escarro, destacando o papel dos componentes do hospedeiro na formação do desenvolvimento do biofilme.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

Biofilmes de Coloração e Microscopia Confocal

1. Após o tempo de crescimento desejado (24-48 horas funciona melhor), retire o meio dos poços da câmara e lave suavemente cada câmara duas vezes com 300 μl de PBS estéril.
2. Prepare a mistura de coloração para biofilme misturando 1 μl de cada corante (fornecido no kit de viabilidade) para cada ml de solução necessário. Faça o corante em água ou solução de mídia.

NOTA: A água é recomendada pelo fabricante.

3. Adicione 200 μl de mistura de corante a cada poço de copo coberto com câmara e incube em temperatura ambiente, no escuro, por 45 minutos.
4. Remova a mistura de manchas das câmaras e lave cada poço com 300 μl de PBS estéril. Remova PBS e substitua por água doce ou mídia.
5. Prossiga com a visualização de biofilmes via microscopia confocal.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lab-Tek II Vidro coberto com câmara, borosilicato #1.5, 8 poços	Thermo Sicher Scientific	155409
Kit de Viabilidade de Biofilmes Vivos/Mortos do Filmtracer	Thermo Fisher Scientific	L10316
Millers LB Roth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Mídia padrão para crescimento noturno/biofilme
Soro Tamponado com Fosfato (Dulbecco A)	Oxoide	BR0014G	Lavagem das câmaras de biofilme após a remoção do meio
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss