Modelagem de Infecção Intestinal em Larvas de Peixe-Zebra usando Bactérias Transmitidas por Alimentos

Resumo

Fonte: Flores, E., et al. Utilizando o protozoário Paramecium caudatum como veículo para infecções alimentares em larvas de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra o método de estabelecer um modelo de infecção intestinal bacteriana transmitida por alimentos em larvas de peixe-zebra, alimentando-as com paramecia infectada com E. coli fluorescente.

Protocolo

1. Infecção alimentar do peixe-zebra
   1. Incube bactérias com Paramecia.
      1. Prepare uma co-cultura de Paramecium caudatum e Escherichia coli MG1655 na noite anterior à infecção. Combine 8 mL de meio E3, 1 mL de uma cultura de paramecia em andamento e 1 mL de uma cultura de E. coli MG1655 (OD₆₀₀ = 1,0) ressuspensos em 1x E3 em frascos de cultura de tecido T25. Incube os frascos em temperatura ambiente (RT) durante a noite. Para cada condição de tratamento, prepare dois frascos de paramecia.
      2. Inocule o meio bacteriano de crescimento (LB (Caldo de Lisogena): 1 g/L de triptona, 0,5 g/L de extrato de levedura, 1 g/L de NaCl) com a cepa infecciosa de bactérias ao retirar uma colônia bacteriana individual de uma placa usando um laço de inoculação estéril. Incube a cultura líquida a 37 °C e deixe agitar a 110 rotações por minuto (rpm) durante a noite.
         NOTA: Equipamentos de proteção individual (jaleco e luvas) devem ser usados, e instalações de nível 2 de biossegurança devem ser usadas ao manusear agentes infecciosos.
      3. No dia seguinte, meça o OD₆₀₀ da cultura durante a noite. Calcule o volume de cultura necessário para atingir um OD600 de 1 quando resuspenso em 11 mL de meio.
      4. Colhe o volume de bactérias por centrifugação a 6.000 x g durante 5 min, um volume para cada frasco de paramecia. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet bacteriano em 1 mL de meio E3.
      5. Opcionalmente, pre-tinga as bactérias com um corante fluorescente.
         1. Adicione 1 μL de coloração bacteriana FM 4-64FX (solução padrão de 5 mg/mL). Cubra o tubo com papel alumínio para proteger contra o fotobranqueamento e incube girando ponta sobre ponta em RT (temperatura ambiente) por 15 minutos.
         2. Remova o excesso de corante lavando com 1x E3: Bactérias do pellet por centrifugação a 6.000 x g por 1,5 min, depois ressuspenda o pellet em 1 mL de meio E3. Repita a etapa de lavagem duas vezes.
         3. Colhe bactérias coradas por cntrifugação a 6.000 x g por 5 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet bacteriano em 1 mL de meio E3.
      6. Adicione 1 mL da suspensão bacteriana a cada um dos dois frascos de paramecia fresca. Incubar em tempo de descanso por 2 horas.
         NOTA: Se estiver trabalhando com bactérias manchadas, incube no escuro em RT por 2 horas
2. Cocultura de bactérias de lavagem/paramecia
   1. Combine o conteúdo dos dois frascos de co-cultura de paramecia/bactérias em um tubo cônico de 50 mL. Centrifuge amostras a 300 x g a 15 °C por 10 minutos. Certifique-se de que a centrífuga esteja pré-resfriada antes dessa etapa.
   2. Remova aproximadamente 10 mL do sobrenadante E3 usando uma pipeta sorológica e adicione aproximadamente 10 mL de E3 1x fresco ao tubo cônico.
      NOTA: Durante todas as etapas de lavagem, é essencial ser muito rápido ao remover o sobrenadante, pois a paramecia começará a nadar para fora do pellet. Gire e remova o sobrenadante de um tubo por vez para garantir um manuseio rápido o suficiente nessa etapa e evitar a perda de paramecia no sobrenadante.
   3. Centrifugar amostras por centrifugação a 300 x g a 15 °C por 5 minutos. Remova aproximadamente 10 mL do sobrenadante E3 usando uma pipeta sorológica e adicione aproximadamente 10 mL de E3 1x fresco ao tubo cônico. Repita essa etapa duas vezes.
   4. Centrifuge amostras a 300 x g a 15 °C por 5 minutos. Remova aproximadamente 10 mL do sobrenadante E3, tomando cuidado para não perturbar o pellet.
   5. Resuspenda o pellet nos restantes 10 mL de meio E3 e transfira 500 μL da suspensão para um novo tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Faça pellets com os 500 μL de paramecia centrifugando a 300 x g por 5 minutos para contar o número de paramecia.
   6. Remova 400 μL do sobrenadante E3 da amostra de 500 μL. Adicione 20 μL de solução de formaldeído a 36,5% aos restantes 100 μL de paramecia e ressuspenda suavemente, incubando por 5 minutos a 22 °C.
      NOTA: Esse passo elimina a paramecia para permitir a contagem.
   7. Meça o volume total real usando a pipeta e grave. Dilua a suspensão paramecia 1:1 v/v com solução de azul de tripano a 0,4%.
   8. Use um contador celular ou hemocitômetro para contar o número de paramecia morta/mL.
      NOTA: Devido à etapa de fixação prévia, a maioria dos paramecia estará morta neste ponto, mas esse número reflete o número de paramecia vivos para o experimento de co-incubação. Os autores não encontraram morte significativa de paramecia devido à co-incubação bacteriana, então isso pode ser descartado como fator aqui.
3. Larvas de Paramecia e peixe-zebra co-incubadas
   1. Calcule a concentração de paramecia no tubo cônico de 50 mL
   2. Calcule o volume de paramecia lavada necessário para uma concentração de 2 x 10⁵ paramecia/mL em um volume final de 3 mL de E3.
      NOTA: A concentração de paramecia pode ser ajustada com base na dosagem bacteriana desejada, que está sujeita a otimização.
   3. Anestesiar peixe-zebra adicionando tricaína em 100 mM de pH 8,0 de Tris até uma concentração final de 100 mg/L. Transfira 10 peixes-zebra para cada poço de uma placa de 6 poços, formando um volume total de 3 mL de E3 fresco contendo a concentração adequada de paramecia. Certifique-se de que as larvas sejam transferidas em uma quantidade mínima de líquido para garantir que se recuperem bem do receptor após a anestesia.
   4. Incubar a 30 °C por 2 horas em uma incubadora diurna sob condições de luz do dia, para garantir condições ideais de iluminação para a presa.
   5. Lave o peixe-zebra pelo menos 5 vezes, transferindo peixes para um novo poço contendo 3 mL de E3 fresco contendo 100 mg/L de tricaína a cada vez.
      NOTA: Não tente omitir a tricaína durante a etapa de lavagem. Transferir larvas móveis sem anestesia aumenta o risco de danos e sofrimento no animal.
   6. Opcionalmente, prepare peixe-zebra para imagem ao incorporar peixe-zebra em 3 mL de agarose de baixa fusão a 1% em uma placa de 6 poços de parede preta: a agarose de baixa fusão é composta em 1xE3 e aquecida em micro-ondas. Quando estiver derretido, adicione tricaína a uma concentração final de 160 mg/mL. Posicione os peixes sob um estereoscópio, usando uma ponta de carregamento em gel clipada, certificando-se de que a cabeça esteja à esquerda e a cauda à direita (Figura 1). Espere 5 minutos para a agarose firmar, depois sobrepor o peixe embutido com 1x E3 contendo 160 mg/mL de tricaína para imagem.

Resultados

Figura 1: Colonização de peixe-zebra com bactérias. Peixes-zebra em 5 dpf foram deixados não infectados (A) ou colonizados com mCherry expressando (B) E. coli ou (C) Salmonella e...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Paramecium caudatum, vivo	Carolina	131554	Não, não armazene culturas de cultivo abaixo da temperatura ambiente
0,4% Solução Trippan Blue	Sigma	T8154-20ML	líquido, filtrado por estéril, adequado para cultura celular; preparado em 0,81% cloreto de sódio e 0,06% fosfato de potássio, dibásico
Dimetil sulfóxido (DMSO)	Sigma	276855-100ML	Armazenado em um armário de segurança para solventes
Escherichia coli, MG1655	ATCC	ATCC 700926	pode ser substituída por qualquer outra cepa não patogênica de E. coli
Coloração FM 4-64FX	Thermo Fisher	F34653	Aliquot e Congelado da Loja
Formaldeído	Sigma	F8775-4X25ML
Caldo LB	Sigma	L3397-1KG
Comprimidos de soro salino tamponado com fosfato	Thermo Fisher	18912014
Tetraciclina	Sigma	87128-25G	tóxico, irritante
Tricaína (Etil 3-aminobenzoato metanosulfonato)	Sigma	E10521-10G
Triton X-100	Sigma	X100-100ML
Solução Trippan Blue, 0,4%	Sigma	93595-50ML
Agarose UltraPure de Baixo Ponto de Fusão	Thermo Fisher	16520050
Hemocitometro ou contador celular	qualquer
Estereoscópio	qualquer
Centrífuga de mesa
Micro-ondas
Roda rotadora
Incubadora aquecida de agitação
Instalações aquáticas
Aquários de reprodução