Desenvolvendo um biofilme monocamada bacteriano usando um reator eletroquímico

Resumo

Fonte: Tokunou, Y. et al., Detecção Eletroquímica do Efeito Cinético de Isótopos de Deutério no Transporte Extracelular de Elétrons em Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a montagem e operação de um modelo de reator eletroquímico projetado para simular a formação de biofilmes em superfícies de eletrodos. A estimulação eletroquímica controlada promove a adesão microbiana, levando ao desenvolvimento gradual de um biofilme bacteriano monocamada.

Protocolo

1. Construção de um reator eletroquímico de três eletrodos (Figura 1)
   1. Coloque um substrato de óxido dopado com índio (ITO) como eletrodo de trabalho na parte inferior do reator.
   2. Em seguida, insira um cilindro de vidro (diâmetro de 2 cm) e uma cobertura de politetrafluoroetileno (PTFE). Em seguida, insira cloreto de prata/prata (Ag/AgCl) (cloreto de potássio, saturado em KCl) e um fio de platina no reator como eletrodos de referência e contra-eletrodo, respectivamente.
      NOTA: Para evitar o vazamento de ar e solução, insira uma folha de borracha butílica entre cada componente.
   3. Adicione 4,0 mL de meio definido (DM) suplementado com 10 mM de lactato e 0,5 g/L de extrato de levedura no reator eletroquímico.
   4. Após confirmar que não há vazamento do reator eletroquímico, o gás nitrogênio para dentro do reator eletroquímico por mais de 20 minutos para manter condições anaeróbias dentro do reator eletroquímico.
      NOTA: Para evitar contaminação com outros microrganismos, o gás deve ser filtrado antes de entrar no reator eletroquímico.
   5. Conecte o reator eletroquímico a um potenciostado e aplique +0,4 V (em vez do eletrodo padrão de hidrogênio, SHE) ao eletrodo ITO, mantendo a temperatura do reator eletroquímico em 30 °C usando um sistema externo de circulação de água.
      NOTA: Para evitar o efeito de um campo elétrico externo, o reator eletroquímico deve ser colocado em uma gaiola de Faraday.
2. Cultivo eletroquímico de células MR-1 de S. oneidensis (Figuras 1 e Figura 2)
   1. Ajuste a densidade celular da suspensão obtida no passo 1.1 para uma densidade óptica de 1,43 a 600 nm (OD₆₀₀) com DM suplementado por 10 mM de lactato e 0,5 g/L de extrato de levedura.
      NOTA: Para obter o OD₆₀₀ correto, aplique a suspensão de célula do OD₆₀₀ ≤ 0,8 a um espectrômetro UV-vis antes de ajustar o OD₆₀₀ para 1,43.
   2. Adicione 0,3 mL da suspensão da célula ao reator eletroquímico através da porta de injeção usando uma seringa: o OD₆₀₀ no reator muda para 0,1.
      NOTA: A adição de uma suspensão de célula de 0,3 mL com OD₆₀₀ = 1,43 em um reator eletroquímico contendo meio de 4,0 mL resulta em 4,3 mL de solução com um OD₆₀₀ = 0,1. Ao usar outros reatores com volumes diferentes, é necessário calcular a densidade da célula.
   3. Continue a aplicação potencial a +0,4 V (em vez de SHE) no eletrodo ITO por 25 horas.
      NOTA: Para a formação de um biofilme monocamada em um eletrodo ITO, certifique-se de que a corrente produzida apresente um desvio inferior a 50% da Figura 2.

Resultados

Figura 1: Reator eletroquímico usado neste estudo. Fotografia da célula eletroquímica antes da construção (a) e após a construção (b). (c) Ilustração esquemática do reator eletroquímico após 25 horas de inoculação eletroquímica a +0,4 V vs SHE.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cilindro de vidro	N/A	N/A	Feito sob medida, usado como reator eletroquímico
Cobertura e base em PTFE	N/A	N/A	Feito sob medida, usado como cobertura e base do reator eletroquímico
Borracha butílica	N/A	N/A	Feito sob medida, inserido entre cada componente do reator eletroquímico
Septa	GL Science	3007-16101	Usado como porta de injeção de reatores eletroquímicos
Eletrodo de óxido dopado com índio (ITO)	GEOMATEC	Nº 0001	Usado como eletrodo de trabalho, 5Ω/sq
Eletrodo saturado em KCl em Ag/AgCl	HOKUTO DENKO	HX-R5	Usado como eletrodo de referência, Φ0,30mm
Fio de platina	A Corporação Nilaco	PT-351325	Usado como contra-eletrodo
Luria-Bertani (LB) Caldo, Moleiro	Becton, Dichkinson e Companhia	244620	Meio para pré-cultivo de S. oneidensis MR-1
Bacto agar	Becton, Dichkinson e Companhia	214010
NaHCO₃	Wako	191-01305	Usado para meio definido (DM)
CaCl₂·2H₂O	Wako	031-00435	Usado para DM
NH₄Cl	Wako	011-03015	Usado para DM
MgCl₂·6H₂O	Wako	135-00165	Usado para DM
NaCl	Wako	191-01665	Usado para DM
Ácido etanossulfônico 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil] (HEPES)	DOJINDO	346-08235	Usado para DM
Solução de lactato de sódio	Wako	195-02305
Extrato de levedura bacto	Becton, Dichkinson e Companhia	212750
Óxido de deutério (D, 99,9%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-PK	Aditivo para experimentos de efeito isotópico cinético
Incubadora	TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.	LTI-601SD	Usado para pré-cultivo
Shaker	TAITEC	NR-3	Usado para pré-cultivo
Máquina de autoclave	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	Usado para esterilização do reator eletroquímico e do meio
Supino limpo	SANYO	MCV-91BNF	Usado para evitar a contaminação do reator eletroquímico e do meio com outros microrganismos
Separador de centrífuga	Eppendorf	5430R	É necessária velocidade de rotação de até 6000×g
Gerador de gás nitrogênio	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	Cilindro de gás nitrogênio também pode ser usado no lugar do gerador a gás
Espectrômetro UV-vis	SHIMADZU	UV-1800	Usado para otimização da densidade celular
Potencióstato	BioLogic	VMP3	Usado para formação de biofilme e experimentos de efeito isótopo cinético
Circulador de água termal	COMO UM SÓ	TR-1A	Usado para manutenção da temperatura de reatores eletroquímicos
Gaiola de Faraday	HOKUTO DENKO	HS-201S	Usado em experimentos eletroquímicos