1. Observação da localização do SKN-1 em resposta à infecção por Streptococcus gordonii <ol><li>Adicione ~100 larvas L4 a cada extrato de levedura Todd–Hewitt (THY) semeado com Streptococcus e a cada meio de crescimento nematoide (NGM) em uma placa de ágar semeada com Escherichia coli (E. coli). Use três placas por cepa de bactéria. Incube as placas por 2 a 3 horas a 25 °C.</li><li>Em seguida, remova as placas da incubadora, lave-as com um tampão M9 modificado (M9W) e recolha as minhocas em tubos cônicos de 15 mL.</li><li>Lave as minhocas 3 vezes.</li><li>Remova a maior parte do M9W por aspiração e adicione 500 μL de M9W contendo 2 mM de azida de sódio ou 2 mM de cloridrato de tetramissolo ao pellet de verme. Isso anestesia os vermes, garantindo que nenhum movimento ocorra ao serem observados ao microscópio. ATENÇÃO: Use equipamentos de proteção individual (EPI) ao manusear azida de sódio. Prepare a solução de azida sob um capuz químico.</li><li>Incube os pellets de minhoca em temperatura ambiente (RT) por 15 minutos. Depois, coloque 15 μL da suspensão de verme sobre uma almofada de agarose preparada. Coloque delicadamente uma capa de cobertura nº 1.5 sobre a almofada de agarose contendo os vermes anestesiados.</li><li>Usando um microscópio fluorescente, visualize a localização do fator de transcrição 1 da família Skinhead, ou SKN-1:GFP (SKN-1 marcado com proteína fluorescente verde), utilizando filtros fluoresceína isotiocianato (FITC) e 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Worms de imagem em ampliações de 10x e 20x.</li><li>Pontue os vermes com base no nível de localização do SKN-1. Sem localização nuclear, a localização de SKN-1B/C::GFP (ISOFORMA B/C marcada com proteína fluorescente verde) na parte anterior ou posterior do verme, e a localização nuclear de SKN-1B/C::GFP em todas as células intestinais são categorizadas como níveis baixos, médios e altos de localização, respectivamente.</li><li>Após pontuar as micrografias fluorescentes, determine as diferenças estatísticas pelos testes qui-quadrados e exatos de Fisher usando software estatístico.</li></ol>

<table class='ck-table-resized'><tbody><tr><td>Mídia e produtos químicos</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>BD Bacto Caldo Todd Hewitt</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0492-17-6</td><td> </td></tr><tr><td>Tubos centrífugos cônicos estéreis de polipropileno de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-269</td><td> </td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td> </td></tr><tr><td>Cloridrato de tetramisolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756</td><td> </td></tr><tr><td>Deslizantes de cobertura nº 1.5 de 18 mm x 18 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td> </td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539-50G</td><td> </td></tr><tr><td>LD002</td><td>IdIs1</td><td>SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td><td>Keith Blackwell</td></tr></tbody></table>

visualizando o estresse oxidativo induzido por patógenos em c. elegans usando skn-1 marcado com gfp

Fonte: <a href='https://app.jove.com/v/59301/studying-oxidative-stress-caused-mitis-group-streptococci'>Naji, A., et al. Estudo do estresse oxidativo causado pelos estreptococos do grupo Mitis em Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)</a>Este vídeo demonstra o uso de SKN-1 marcado com proteína fluorescente verde em C. elegans para monitorar o estresse oxidativo ao rastrear a fluorescência verde. Vermes expostos a S. gordonii apresentam forte fluorescência nuclear, confirmando estresse induzido por patógenos, enquanto aqueles alimentados com E. coli apresentam fluorescência verde difusa no citoplasma, indicando ativação mínima do SKN-1.

Visualizando o Estresse Oxidativo Induzido por Patógenos em C. elegans usando SKN-1 marcado com GFP

Source: Naji, A., et al. Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)This video ...

https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/24504/24504_article_thumb_24504.jpg

Comece com duas placas contendo vermes C. elegans que expressam SKN-1 com proteína fluorescente verde, um fator de transcrição localizado no citoplasma intestinal. Esses vermes também contêm grânulos de lipofuscina intestinal que apresentam autofluorescência.Uma placa é semeada com bactérias não patogênicas como grupo controle, a outra com bactérias patogênicas como grupo de teste.No grupo teste, o peróxido de hidrogênio produzido pelo patógeno induz estresse oxidativo, desencadeando a translocação de SKN-1 para núcleos intestinais.No grupo controle, a maior parte do SKN-1 permanece distribuída de forma difusa no citoplasma.Lave cada placa com um buffer e transfira os vermes para tubos.Centrifuge para separar os vermes e remover o amortecedor.Adicione um meio contendo azida de sódio para anestesiá-los.Monte as minhocas em almofadas de agarose, coloque os lâmpados de cobertura e observe sob um microscópio de fluorescência. Use a autofluorescência para visualizar os limites nucleares.Sinal forte de SKN-1 nuclear no teste, em relação ao sinal citoplasmático difuso nos controles, indica relocalização nuclear e confirma o estresse oxidativo induzido por patógenos.Usando uma pipeta, adicione aproximadamente 100 larvas de L4 a cada placa com sementes de THY com estreptococo e em placas com sementes de E. coli em NGM. Use três placas por cepa de bactéria.Incube as placas por 2 a 3 horas a 25 graus Celsius. Em seguida, remova as placas da incubadora. Lave com M9W e colete as minhocas em tubos cônicos de 15 mililitros.Lave as minhocas três vezes do que feito anteriormente na etapa centrífuga. Remova a maior parte do M9W por aspiração. E adicione 500 microlitros de M9W contendo 2 milimolares de azida de sódio ou cloridrato de tetramissolo ao pellet de verme para anestesia.Incube o tubo com pellets de minhoca em temperatura ambiente por 15 minutos. Depois, despeje 15 microlitros da suspensão de verme sobre uma almofada de agarose preparada. Sob um microscópio fluorescente, visualize a localização do SKN-1 utilizando filtros FITC e DAPI.Imagem worms com ampliações de 10 vezes e 20 vezes. Pontuar os worms com base em três níveis de localização; localização baixa, onde não se observa localização nuclear, localização média, com SKN-1 BCGFP na parte anterior ou posterior do verme, e alta localização, onde a localização nuclear de SKN-1 BCGFP é observada em todas as células intestinais.

visualizing-pathogen-induced-oxidative-stress-c-elegans-using-gfp

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Microbiology

Bacterial Pathogenesis and Host Interactions

bacterial-pathogenesis-and-host-interactions

Bacterial Virulence & Biofilms

Visualizing Pathogen-Induced Oxidative Stress in C. elegans Using GFP-Tagged SKN-1

71 visualizações. Comece com duas placas contendo vermes C. elegans que expressam SKN-1 com proteína fluorescente verde, um fator de transcrição localizado no citoplasma intestinal. Esses vermes também contêm grânulos de lipofuscina intestinal que apresentam autofluorescência.Uma placa é semeada com bactérias não patogênicas como grupo controle, a outra com bactérias patogênicas como grupo de teste.No grupo teste, o peróxido de hidrogênio produzido pelo patógeno induz estre...

Visualizando o Estresse Oxidativo Induzido por Patógenos em C. elegans usando SKN-1 marcado com GFP

In This Article

Abstract

Protocol

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mídia e produtos químicos
BD Bacto Caldo Todd Hewitt	Fisher Scientific	DF0492-17-6
Tubos centrífugos cônicos estéreis de polipropileno de 15 mL	Fisher Scientific	12-565-269
Azida de sódio	Sigma Aldrich	S2002-25G
Cloridrato de tetramisolo	Sigma Aldrich	L9756
Deslizantes de cobertura nº 1.5 de 18 mm x 18 mm	Fisher Scientific	12-541A
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell