Visualizando o Estresse Oxidativo Induzido por Patógenos em C. elegans usando SKN-1 marcado com GFP

Resumo

Fonte: Naji, A., et al. Estudo do estresse oxidativo causado pelos estreptococos do grupo Mitis em Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o uso de SKN-1 marcado com proteína fluorescente verde em C. elegans para monitorar o estresse oxidativo ao rastrear a fluorescência verde. Vermes expostos a S. gordonii apresentam forte fluorescência nuclear, confirmando estresse induzido por patógenos, enquanto aqueles alimentados com E. coli apresentam fluorescência verde difusa no citoplasma, indicando ativação mínima do SKN-1.

Protocolo

1. Observação da localização do SKN-1 em resposta à infecção por Streptococcus gordonii

1. Adicione ~100 larvas L4 a cada extrato de levedura Todd–Hewitt (THY) semeado com Streptococcus e a cada meio de crescimento nematoide (NGM) em uma placa de ágar semeada com Escherichia coli (E. coli). Use três placas por cepa de bactéria. Incube as placas por 2 a 3 horas a 25 °C.
2. Em seguida, remova as placas da incubadora, lave-as com um tampão M9 modificado (M9W) e recolha as minhocas em tubos cônicos de 15 mL.
3. Lave as minhocas 3 vezes.
4. Remova a maior parte do M9W por aspiração e adicione 500 μL de M9W contendo 2 mM de azida de sódio ou 2 mM de cloridrato de tetramissolo ao pellet de verme. Isso anestesia os vermes, garantindo que nenhum movimento ocorra ao serem observados ao microscópio.
   ATENÇÃO: Use equipamentos de proteção individual (EPI) ao manusear azida de sódio. Prepare a solução de azida sob um capuz químico.
5. Incube os pellets de minhoca em temperatura ambiente (RT) por 15 minutos. Depois, coloque 15 μL da suspensão de verme sobre uma almofada de agarose preparada. Coloque delicadamente uma capa de cobertura nº 1.5 sobre a almofada de agarose contendo os vermes anestesiados.
6. Usando um microscópio fluorescente, visualize a localização do fator de transcrição 1 da família Skinhead, ou SKN-1:GFP (SKN-1 marcado com proteína fluorescente verde), utilizando filtros fluoresceína isotiocianato (FITC) e 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Worms de imagem em ampliações de 10x e 20x.
7. Pontue os vermes com base no nível de localização do SKN-1. Sem localização nuclear, a localização de SKN-1B/C::GFP (ISOFORMA B/C marcada com proteína fluorescente verde) na parte anterior ou posterior do verme, e a localização nuclear de SKN-1B/C::GFP em todas as células intestinais são categorizadas como níveis baixos, médios e altos de localização, respectivamente.
8. Após pontuar as micrografias fluorescentes, determine as diferenças estatísticas pelos testes qui-quadrados e exatos de Fisher usando software estatístico.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mídia e produtos químicos
BD Bacto Caldo Todd Hewitt	Fisher Scientific	DF0492-17-6
Tubos centrífugos cônicos estéreis de polipropileno de 15 mL	Fisher Scientific	12-565-269
Azida de sódio	Sigma Aldrich	S2002-25G
Cloridrato de tetramisolo	Sigma Aldrich	L9756
Deslizantes de cobertura nº 1.5 de 18 mm x 18 mm	Fisher Scientific	12-541A
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell