Preparação de um modelo de aspiração orofaríngea murina para estabelecer infecções bacterianas nos pulmões

Resumo

Fonte: Nielsen, T. B., et al., Modelo de Aspiração Orofaríngea Murina de Pneumonia Bacteriana Associada a Ventiladores e Hospitalares. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o procedimento de administrar bactérias através da orofaringe até os pulmões de um camundongo anestesiado para induzir infecção pulmonar e desencadear uma resposta imune.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.

1. Inoculação/Infectação de Ratos

1. Suspenda um rato anestesiado, pendurando-o pelos incisivos superiores em um fio forte e fino (por exemplo, fio dental) preso a um objeto fixo a uma altura aproximadamente duas vezes o comprimento do corpo do rato (por exemplo, 20 cm) acima da superfície de operação (por exemplo, bancada de laboratório).
2. Puxe suavemente a língua do rato para fora da boca usando uma pinça estéril e de ponta romba. Transfira a língua para um dedo estéril enluvado para evitar esmagar acidentalmente a língua do rato. Mantenha a língua fora da boca, permitindo o acesso ao orofaringe e impedindo a deglutição do inóculo lateral.
3. Enquanto segura a língua do camundongo, coloque o inoculo de 50 μL (suspensão bacteriana) na orofaringe usando uma micropipeta; A orofaringe está localizada na junção da cavidade oral com a faringe, em direção à parte posterior da boca.
   NOTA: É muito importante entregar o líquido apenas pipetando até o primeiro ponto da micropipeta. O camundongo para de respirar por alguns segundos quando o inóculo é colocado na orofaringe; Eventualmente, a aspiração reflexa fará com que o camundongo inale a suspensão bacteriana, indicado pelo característico estalo do líquido entrando nos pulmões, que resulta em infecção por pneumonia.
4. Se o inóculo não for colocado suficientemente para trás para bloquear a respiração normal, comprima as narinas com uma pinça para forçar a aspiração reflexa pela boca e a subsequente inalação do inóculo.
5. Após a inoculação, solte a língua, retire o camundongo da corda de suspensão, coloque-o em uma gaiola e monitore até acordar da anestesia.

2. Monitoramento da Progressão da Doenças

NOTA: Devido ao sofrimento animal, vários indicadores devem ser usados para indicar quando os camundongos ficam moribundos; a eutanásia deve ser realizada após essa determinação, de acordo com um protocolo IACUC previamente aprovado; vários marcadores de moribundez incluem temperatura corporal, perda de peso, aparência, marcha e outros biomarcadores que podem ser obtidos do sangue (por exemplo, via iSTAT).

1. Eutanasie os camundongos de acordo com o protocolo IACUC previamente aprovado (por exemplo, CO₂ seguido de luxação cervical).
2. Remova os pulmões de um camundongo eutanasiado cortando a traqueia, artéria pulmonar e veia pulmonar próximas aos pulmões.
   1. Microscopia
      1. Coloque os pulmões (ou porção) em um molde de amostra.
      2. Preencha o molde da amostra com composto de temperatura de corte ideal (O.C.T.), submergindo completamente o tecido.
      3. Congele a amostra a -80 °C.
      4. Envie a amostra para um laboratório de patologia para seccionar e montar em lâminas para microscopia.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Câmara de Anestesia	Kent Scientific Corporation	VetFlo-0720	Acomoda até 5 camundongos
Criomolde, tamanho intermediário	Sakura Tissue-Tek	4566	Moldes descartáveis de vinil para amostras, 15×15×5 mm
Fio dental	Oral-B	37000469537	Amarração ao poste de estábulo aproximadamente 6" acima da altura da mesa
Pinças	VWR	82027-440	Costumava puxar suavemente a língua da boca do rato
Isoflurano para anestesia	Abbott	10015516	Pode ser usado um medicamento alternativo; Modificar o procedimento conforme
Cartucho iSTAT	Abbott	03P79-25	Diversos cartuchos estão disponíveis para atender às suas necessidades
Cetamina, 100 mg/mL	Suprimentos Médicos Ocidentais	4165	Dilua 1:10 em PBS a 1 mg/mL e combine com xilazina a 1 mg/mL
Pomada para Olhos	Akorn	Lágrimas Renovadas	Evite tocar o olhar com a ponta do dispensador
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Corning	21-031-CM	PBS de Dulbecco sem cálcio e magnésio
Pontas de Pipeta, 200-μL	VWR	10017-044	Autoclave antes do uso
Pipetter, 200-μL	Gilson	Pipetman P200	Autoclave e calibração antes do uso
Espalhador, Célula Bacteriana	Bel-Art	F377360006	Esterilize assando ou usando autoclave antes de cada uso
Frasco, criogênico, 2,0 mL	Corning	430659	Usado para armazenamento criogênico de inóculos bacterianos concentrados