Tratamento ativado pela luz de biofilmes bacterianos usando um precursor fotosensimizador

Resumo

Fonte: Zhao, K., et al. Um modelo In Vitro para Estudar o Efeito da Terapia Fotodinâmica Mediada por Ácido 5-Aminolevulínico no Biofilme de Staphylococcus aureus . J. Vis. Exp. (2018)

O vídeo demonstra um protocolo de terapia fotodinâmica para avaliar os efeitos antibacterianos em biofilmes bacterianos Gram-positivos. Os biofilmes são divididos em quatro grupos: dois recebem um precursor fotosensimizador e dois recebem um tampão. Todos são incubados no escuro, seguidos por exposição à luz vermelha a um grupo tratado por precursor e um grupo apenas tampão. Espécies reativas de oxigênio são geradas apenas no grupo que recebe tanto precursor quanto luz, levando à morte celular bacteriana. A viabilidade é comparada entre todos os grupos para avaliar a eficácia do tratamento.

Protocolo

1. Formação de Biofilmes

1. Formação de biofilme em microplacas de 96 poços
   1. Recupere a cepa Staphylococcus aureus USA300 e as cepas clínicas formadoras de biofilme 3 (C1-C3) armazenadas a -80 °C.
      NOTA: A capacidade das cepas clínicas de formar biofilmes foi determinada pelo ensaio de placa microtitulante.
   2. Inocule a bactéria em meio de 5 mL de caldo de soja de triptona (TSB) e cultive em incubadora com agitação a 37 °C durante a noite até a fase estacionária.
   3. Centrifuge a cultura bacteriana durante a noite a 4.000 × g por 10 minutos a 25 °C e descarte o sobrenadante. Ressuspenda os pellets em soro salino tamponado com fosfato (PBS) até uma concentração final de 2,0 × 10 unidades formadoras de^colônia (CFU)/mL.
      NOTA: A concentração da bactéria foi estimada medindo a densidade óptica e posteriormente determinada pela contagem de placas, revelando que 1 OD₆₀₀ de suspensão continha 1,5 × 10⁸ CFU/mL.
   4. Dilua a suspensão bacteriana para 1:200 (1,0 × 10⁷ UFC/mL) em meio TSB contendo 0,5% de glicose. Inocular 200 μL de suspensão bacteriana em cada poço de uma microplaca de poliestireno de 96 poços tratada em cultura celular.
   5. Incube a microplaca estaticamente a 37 °C por 24 horas em um ambiente bem oxigenado.
      NOTA: O tempo de incubação para a formação de biofilmes maduros pode variar para diferentes cepas bacterianas; isso deve ser determinado antes do experimento de Terapia Fotodinâmica (PDT).
   6. Descarte o meio nos poços e lave os poços de microplacas suavemente com PBS três vezes e depois descarte o sobrenadante.
      NOTA: A etapa deve ser realizada com muito cuidado para evitar perturbar o biofilme formado.

2. Irradiação de luz

1. Armazene o ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) em uma geladeira de 4 °C. Antes do experimento, dilua o 5-ALA com PBS até 10 mM.
   NOTA: A solução 5-ALA deve ser preparada frescamente antes do experimento.
2. No grupo experimental, adicione 200 μL de 10 mM de ALA a cada poço da microplaca ou 2 mL ao prato de cultura. Cubra o prato/prato com papel alumínio e incube por 1 hora. Em seguida, irradie a placa/antena com um diodo emissor de luz (LED) com intensidade luminosa de 100 mW/^cm2 por 1 hora para alcançar uma dose de luz de 360 J/^cm2 em um comprimento de onda principal de 633 ± 10 nm.
   NOTA: Para permitir que a energia luminosa seja entregue de forma eficaz e igualitária ao biofilme em todos os poços/antenas, fixe a distância do pico da fonte de luz até o poço/antena em 6,0 cm, e limite a região experimental à área central de irradiação (10 cm × 8 cm). Para garantir que os resultados sejam reprodutíveis, os experimentos devem ser realizados na mesma temperatura ambiente. Na etapa de irradiação de LEDs, para evitar a exposição direta da placa a outras fontes de luz, como luz solar, iluminação de ambientes ou luz de luminária, o LED era ligado antes de mover a placa/antena para a área de irradiação, e a luz era forte o suficiente para concluir a operação.
3. Configurem os grupos de controle (três grupos de controle foram criados em nosso experimento).
   1. Para o primeiro grupo controle (ALA-LED-), adicione 200 μL de PBS a cada poço da microplaca ou 2 mL ao prato de cultura. Cubra o prato/prato com papel alumínio e incube por 2 horas.
   2. Para o segundo grupo controle (ALA+LED-), adicione 200 μL de 10 mM de ALA a cada poço da microplaca ou 2 mL ao prato de cultura. Cubra o prato/prato com papel alumínio e incube por 2 horas.
   3. Para o terceiro grupo controle (ALA-LED+), adicione 200 μL de PBS a cada poço da microplaca ou 2 mL ao prato de cultura. Cubra o prato/prato com papel alumínio e incube por 1 hora. Em seguida, exponha a placa ao LED com irradiação de luz de 360 J/^cm2 em um comprimento de onda principal de 633 ± 10 nm.
      NOTA: Na etapa de irradiação de LEDs, evite a exposição direta da placa a outras fontes de luz, como luz solar, iluminação de ambientes ou luz de luminária.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caldo de Soja de Triptona (TSB)	OXOIDE	CM0129B
SYTO9	Thermo Fisher Scientific	L7012	Os Kits de Viabilidade Bacteriana LIVE/DEAD do BacLight
Prodídio iodeto (PI)	Thermo Fisher Scientific	L7012	Os Kits de Viabilidade Bacteriana LIVE/DEAD do BacLight
Ácido 5-aminolevulínico (ALA)	Fudan Zhangjiang Bio-Farmácia	3.1
Staphylococcus aureus cepa USA300			Referências ao USA 300
Cepas clínicas de Staphylococcus aureus (C1-C3)			Todas as cepas clínicas foram isoladas de pacientes com rinossinusite crônica
Microplaca de 96 poços	Corning Inc	3599	Microplacas de poliestireno transparente com base plana tratadas com TC, enroladas individualmente, com tampa, estéreis
Microcentrífuga Eppendorf 5417	Eppendorf	Z365998 | SIGMA
Incubadora	Thermo Fisher Scientific	SHKE4000	Shakers Orbitais de Bancada MaxQ 4000
Diodo emissor de luz (LED)	Wuhan Yage Técnica Óptica e Eletrônica CO	LED-IB